Cell Rep：无需参考的甲基化分析新方法（附原文）

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来源： MedSci / 作者： / 2015-12-21' ?# ]) p1 n" F! a) @

% }7 l! k/ M3 E/ o, H分析DNA甲基化的高通量方法大多依赖参考基因组，而许多物种不一定有。最近，奥地利的研究人员就开发出一种方法，在没有参考基因组的情况下分析DNA甲基化。这项成果发表在Cell Reports上。7 v( ^% E: m$ M: O. D7 ]9 l' M7 r
文章的第一作者是奥地利科学院CeMM分子医学研究中心的Johanna Klughammer。她及其同事将简化甲基化测序（reduced representation bisulfite sequencing，RRBS）与一种名为RefFreeDMA的应用程序相结合。这种程序能从RRBS读取中推断出基因组，并发现样品中差异甲基化的区域。她们开发的这个流程依赖于脊椎动物中DNA甲基化的非随机分布，大多数甲基化都位于CpG位点。+ N9 [4 I! o' ]8 F* q' r
在她们这个方法中，DNA先通过限制性内切酶Mspl和/或Taql消化，这两种酶分别切割C^CGG和T^CGA，并且对甲基化不敏感。之后，这些消化后的序列被用来创建RRBS测序文库。研究人员指出，他们利用九个物种（人、小鼠、大鼠、牛、狗、鸡、鲤鱼、鲈鱼和斑马鱼），验证和优化了96孔RRBS方法的基因组覆盖度和样品通量，将所覆盖的CpG位点数量从250万个提高到400万个。" P( b1 L) ^3 E/ V( g( A
RefFreeDMA是一个基于Linux的软件流水线，利用了RRBS读取的特点，如明确的起始和中止点。通过汇集特定物种中所有样品的RRBS读取，这个应用程序推断出每个集群的一致序列。在胞嘧啶和胸腺嘧啶同时存在的情况下，研究人员指出，胞嘧啶被保留，因为这可能反映了甲基化的胞嘧啶。
3 o1 l+ X* D# w6 i* [' v一旦生成了推导的基因组，研究人员便利用BSMAP/RRBSMPA将读取与一种自定义的DNA甲基化检出脚本相比对，以评估每个CpG位点的甲基化部分。随后，研究人员将差异甲基化的读取进行排序。那些排名靠前的读取被导出为FASTA/FASTQ文件，通过已注释的相关基因组来进行生物学解释。7 I7 {7 n, q- D. T
为了验证这种方法，Klughammer及其同事将其应用在三个物种（人、牛和鲤鱼）的44个样品中，并比较了无参考和有参考的分析。他们发现，对于两种方法，CpG位点的平均DNA甲基化水平在很大程度上是相似的。同时，推导的基因组也大体反映了参考基因组。例如，1,522,786个推导基因组片段中的1,254,324个可比对到人类基因组。“我们对代表性染色体的比对位置进行作图时，发现这两种方法有着很好的一致性，而对于所有样品和所有物种，这两种方法所获得的DNA甲基化值也高度一致，”Klughammer及其同事在文中写道。研究人员指出，这种方法不仅能够应用于野生种群，也能够应用于农业和水产养殖的样品。
6 f1 r6 P& l, ~3 @: rhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/257328288 Q$ M4 T% c. A2 |9 I

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6 {! \/ R! e0 F$ n$ [; o& l9 M) H2楼原文 感谢WeiTing 提供

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Single-Cell DNA Methylome Sequencing and Bioinformatic Inference of Epigenomic Cell-State Dynamics

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8 P3 Y6 J+ p# `( W) G) \- K8 A谢谢提供原文。