求助！！！犬脂肪干细胞成骨分化

若爱請深爱

实验没有人带，自己摸索中，浪费了很多时间，希望做过实验的前辈们多多帮忙指教！！万分感谢！！' D  o4 m! w6 d" z0 N
我在做犬脂肪干细胞的增殖和成骨分化，前辈们帮我看看哪一步出了问题！谢谢！
7 y+ n) b7 o+ y1 n: B1.成骨诱导液：10mmol/L的β磷酸甘油钠、50ug/ml的VC、0.1umol/L的地米，溶解于10%FBS的DMEM-HG培养基。& o. v6 P5 p& v+ y4 J8 g
2.以2×10的四次方个/ml，500ul/孔的p3代细胞接种于24孔板，长至50%时换成骨诱导液，之后每隔2-3天换液一次。( u, R, J, Y: v9 Z+ i! E1 Q
3.在成骨诱导第13天时，我做了以下检测：% n5 F( ^/ l, |; a( f
（1）ALP检测：用0.1%的triton-x100，100ul/孔，室温，2h：裂解细胞
0 ~1 S. X6 H9 C+ Q* J! p( \- l  W                       用ALP试剂盒侧od值
8 A1 ~4 k: Q0 Y$ o3 ~7 `% K        结果：实验组od接近空白组。8 y% m  Q/ \8 h+ {3 B+ i0 U1 W
（2）茜素红染色：所有试剂都用1M的NaOH调ph至9." |! J% @4 Z' n) H# w
                            4%多聚甲醛，室温，20分钟，三蒸水洗三次，0.1%茜素红（用0.1M的tris-hcl，ph9溶解）500ul/孔，室温10分钟，弃掉，PBS10分钟，弃掉。; t) W* J/ B( ?$ v1 @
        结果：没有被染成红色的物质。
% F0 r9 P1 G/ @4 H+ w  [
$ s' J1 o' Z, C: i% _另：细胞长满后，越来越少，后来几乎没有，取而代之是黑色的颗粒越来越多。。。觉得应该是异常的。$ t2 M. I; m3 p) e+ q
希望有经验的前辈可以告诉我：
- B# h. n' F9 ]8 g# ~$ C  a1.我的成骨液配比有无问题？
! [1 ]# y2 E. d0 j8 X2.24孔板的细胞接种密度、长至50%时开始成骨诱导有无问题？0 J" Z, s. J0 N( J
3.诱导后21天内细胞是否会消失，取而代之别的东西？- F9 S( W, N/ n0 x/ w
4.我的ALP检测中，细胞裂解过程有无问题？' a7 ]( d; ?, k; w  T3 }" j( ?
5.我的茜素红染色中，整体操作有无问题？
3 d. ?( r3 k  Q/ b: w7 u; o6.成骨液配好后可以存放大概多久呢？
* M1 p  B9 s' o" n. M4 L! C7 _! W. k非常非常感谢前辈们不吝赐教！！！
6 o- e0 f" w; T' G( \小妹在此谢过！9 l+ Z. W5 ?8 u7 K% O5 @4 ?" I
自己摸索试验好痛苦，转眼已经4个多月了，还在做预实验。。。3 N* u/ o6 {! s0 R6 K* Z
希望大家帮帮忙~~

ytumuyangren

首先，确认一下楼主在做脂肪干细胞成骨诱导前的培养时，采用的是什么培养基？其次，我们做的时候是待细胞长至70%后才更换为成骨诱导液，我们坚持碱性磷酸酶是在成骨诱导9d是用sigma的ALP检测试剂盒做染色用；成骨诱导15d后用茜素红做钙结节染色鉴定，效果还不错，只不过我们做的是人脂肪来源间充质干细胞。希望对楼主有所帮助，预祝楼主实验顺利！

若爱請深爱

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8 G, n" W4 F7 _3 w! T" d- t太感动了！谢谢前辈！！  e) t" @' R) B) `* x
成骨诱导前，我用的是sigma的DMEM-HG粉末用三蒸水配制的培养基，加10%的FBS。成骨诱导液的三种药就是直接加在以上这个培养液中。
3 a2 c" I* \/ D4 c4 {- l有个不情之请，不知道前辈可以把你的成骨诱导液的配方，和成骨诱导具体的方法（什么培养板、细胞量），茜素红染色的具体方法告知呢（另，是否需要调节ph到9，或者您的试剂的ph是多少呢）？
( s7 h8 l2 S+ F) q1 |) Z3 V实在太感谢了！！！

ytumuyangren

回复 若爱請深爱 的帖子, \! V- C- v; H* A# ~

8 \4 W& t7 X6 @2 }( Y- i, P楼主，你可以尝试换一种培养基，细胞正常培养我们选用的是Hyclone或者Gibco的a-MEM+10%FBS，因为H-DMEM本身就会诱导细胞不定向那个方向分化，而且H-DMEM培养MSC后，MSC的干性得不到维持，容易分化；另外成骨诱导因子就和楼主给出的因子是一样的，茜素红是购买的现成的，培养板用过24孔板和6孔板，接种细胞量是1*104/cm2;希望对楼主有所帮助，预祝实验顺利！

Albertchen

额，做成骨诱导的时候建议你先在给培养板铺一层明胶，另外感觉你的诱导起始点太早了，建议还等细胞再长一下，大概等细胞汇合度长到70%左右的时候开始做诱导会比较好的，另外因为hADSC相对于狗的ADSC做成骨会相对快一点，所以，茜素红染色的时候大概要等到三周左右，如果你比较急着想知道能不能诱导出来，前期可以做一个碱性磷酸酶的检测。
, R2 I( ~9 V. M另外你问的接种密度，接种在6孔板里面的密度建议为2万/cm^2，板子提前铺明胶了成功率会提高很多，茜素红有现成的工作液卖，所以就不会存在啥问题了啦。哈哈，祝实验成功~~

Albertchen

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1.成骨诱导分化结束后，吸走六孔板中的成骨诱导分化完全培养基，用1×PBS冲洗1-2次。每孔加入2mL4%中性甲醛溶液，固定30min。* H2 `: [! R3 a' U& v
2.吸走中性甲醛溶液，用1×PBS冲洗2次。每孔中加入1mL茜素红染液染3-5min。; B2 r" _) Q2 G" u6 w- U
3.吸走茜素红染液，用1×PBS冲2-3次。( M( N) i/ p9 c9 z' X
4.将培养板置于显微镜下观察成骨染色效果。$ G" [$ t) B9 \) Q
' D8 _6 }* f) ^/ V. h
这是你要的茜素红染色方法