跑胶出现三条带？

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回复 nichifanlema2 的帖子* ^" j* `* z3 o& y- `1 C

' |& W: S& k/ iTakara

gxbzjznn

回复 king8 的帖子# V- {' O; l. J4 D9 r' G

. j$ i+ i; ?& d/ j. ^不可能是特异性扩增吧？因为片段差距很大啊 我的product length 是200bp  中间还有最下面的都在50bp以下  另外请问一下 你们设计引物的时候看Self complementarity 以及Self 3' complementarity的值么？他们跟TM值以及GC含量之间有冲突时该如何选择？有优先选择顺序码？谢谢

gxbzjznn

回复 云飘过的思念 的帖子1 q) Y( S, A6 \& U* J: {5 z7 h

% i2 o1 n6 b2 [4 F我们用核酸染料是Gelview

gxbzjznn

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: f7 g8 O# K) k5 ]7 ~
* j/ d) v. s0 q/ ?, V' t0 P3 l我是按照引物合成回来以后引物管上标注的体积加对应的TE buffer溶解以后再用水稀释十倍的 （取10ul到另一个新的1.5ml离心管再加90ul无酶水） ！  这样浓度还大的话该怎么稀释呢？你们一般都是怎么稀释引物呢？

云飘过的思念

0 ^6 q$ w9 A  H/ Y. w6 h4 D$ ^4 X! N9 r* u# f+ ]! S! v
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1 Y5 Y1 [  O( T
) A" c" c0 b6 C) x! ?. ?恩，具体染料可以分很多种，只要能在特定波长激发光下发光即可，但是染色方法是胶染哈，嘿嘿

云飘过的思念

. f7 T; b0 [, P1 y& F: W. D( E

gxbzjznn 发表于 2016-1-13 22:38
' `, c7 j' S8 s* y回复 nichifanlema2 的帖子
! A, ~# U5 d1 h" J) \: Z9 M  z: |  e/ [) N' s9 p" `' H
我是按照引物合成回来以后引物管上标注的体积加对应的TE buffer溶解以后再用水 ...

. p) J3 n# T+ }; p6 M

& j3 ~$ @& |* k4 e% O我们之前溶解引物的方法如下，仅供参考
/ M0 |" J- z7 x9 F7 I实测浓度（ng/ul）=实测260值*33*稀释倍数
" n6 a' X7 {. L8 W+ b/ z实际浓度（uM）= 实测浓度（ng/ul）*1000/M.W+ X' T% [) ~3 L4 ?3 I, ^' T+ @
补水量（ul）= 实际浓度（uM）*（总体积-测OD消耗体积）/定溶浓度（uM）- （总体积-测OD消耗体积）
# o& G4 H* x) m) ?) H5 ]5 o1 E' v# w, A
0 K! K' n+ x% F6 R定量设备为NanoDorp2000

nichifanlema2

回复 gxbzjznn 的帖子6 c7 g' P9 I& |7 F

: Y) P) T# s8 S. p: C引物二聚体的出现不一定会出现在每次扩增和其它基因的扩增中，其跟引物的设计有关。个人认为，在基因扩增时，引物的都是过量的，如果两对引物直接有4个（含）以上的碱基配对，引物二聚体就常常会出现，在不影响基因扩增和表达趋势的情况下，可以忽略不计。通常使用时的引物浓度为10uM,如果引物二聚体较为明显，或者影响了扩增，可以适当降低引物浓度。另外，为了提高扩增效率和扩增时的特异性，可以提高退火温度。