跑胶出现三条带？

gxbzjznn

回复 nichifanlema2 的帖子
" }% }6 U) R3 u! K
* x- }: C/ J+ A1 B1 q, N/ XTakara

gxbzjznn

回复 king8 的帖子7 J6 K( |7 t: |5 w( |4 h2 g" h+ `

& p! z* v1 `0 l( _& v/ U) K* q不可能是特异性扩增吧？因为片段差距很大啊 我的product length 是200bp  中间还有最下面的都在50bp以下  另外请问一下 你们设计引物的时候看Self complementarity 以及Self 3' complementarity的值么？他们跟TM值以及GC含量之间有冲突时该如何选择？有优先选择顺序码？谢谢

gxbzjznn

回复 云飘过的思念 的帖子
: o. i- H& c1 z0 S2 `7 J" D  ~) s( S- }6 ~1 {- u) i4 R
我们用核酸染料是Gelview

gxbzjznn

回复 nichifanlema2 的帖子: |3 L2 t: c3 |2 _5 e

4 B5 P+ R* n% j  c我是按照引物合成回来以后引物管上标注的体积加对应的TE buffer溶解以后再用水稀释十倍的 （取10ul到另一个新的1.5ml离心管再加90ul无酶水） ！  这样浓度还大的话该怎么稀释呢？你们一般都是怎么稀释引物呢？

云飘过的思念

% `6 T1 |; U- f4 B9 ?# @4 r
- ~; b# p, y* z回复 gxbzjznn 的帖子% B6 \3 M9 n# y$ K, w

6 |, S. H  r% }5 V& E* n( C8 r恩，具体染料可以分很多种，只要能在特定波长激发光下发光即可，但是染色方法是胶染哈，嘿嘿

云飘过的思念

4 m! u4 X6 x7 f7 }: v

gxbzjznn 发表于 2016-1-13 22:38 ; m* r0 ~/ X/ e2 H2 B! o
回复 nichifanlema2 的帖子
! V# N$ Y  U+ E1 g; O* X( Y6 i8 B
我是按照引物合成回来以后引物管上标注的体积加对应的TE buffer溶解以后再用水 ...

0 ^7 t8 c- D+ s& q/ N# @) ~5 O( p* O% n  L# m, r
我们之前溶解引物的方法如下，仅供参考
7 @* y# `0 e# H% t2 [2 G实测浓度（ng/ul）=实测260值*33*稀释倍数
* Z3 f; k  V( Z! a& K0 Y1 n/ n实际浓度（uM）= 实测浓度（ng/ul）*1000/M.W' _. \* v) ^1 i" B3 s. X. E  A
补水量（ul）= 实际浓度（uM）*（总体积-测OD消耗体积）/定溶浓度（uM）- （总体积-测OD消耗体积）
, J* Y9 ?2 J7 ^6 k, D7 U7 V" i: J" g; t, K5 d+ f% ]- f  C
定量设备为NanoDorp2000

nichifanlema2

回复 gxbzjznn 的帖子
( w# r" P- `$ C6 V+ [8 X' ~: n, w% X4 g
引物二聚体的出现不一定会出现在每次扩增和其它基因的扩增中，其跟引物的设计有关。个人认为，在基因扩增时，引物的都是过量的，如果两对引物直接有4个（含）以上的碱基配对，引物二聚体就常常会出现，在不影响基因扩增和表达趋势的情况下，可以忽略不计。通常使用时的引物浓度为10uM,如果引物二聚体较为明显，或者影响了扩增，可以适当降低引物浓度。另外，为了提高扩增效率和扩增时的特异性，可以提高退火温度。