跑胶出现三条带？

gxbzjznn

回复 nichifanlema2 的帖子  {% Q( D# l/ l" y# C0 E8 z
4 N) k7 N  c% }! w6 k
Takara

gxbzjznn

回复 king8 的帖子8 I4 v1 o8 F2 |7 _& h
  T4 {( y0 p- R7 F9 [5 [
不可能是特异性扩增吧？因为片段差距很大啊 我的product length 是200bp  中间还有最下面的都在50bp以下  另外请问一下 你们设计引物的时候看Self complementarity 以及Self 3' complementarity的值么？他们跟TM值以及GC含量之间有冲突时该如何选择？有优先选择顺序码？谢谢

gxbzjznn

回复 云飘过的思念 的帖子
, d6 B9 z7 u. F% p+ R, K) B" r- e# h: X1 B+ T) U  b
我们用核酸染料是Gelview

gxbzjznn

回复 nichifanlema2 的帖子3 @- p8 n" s! z

; R, }( B/ f. X我是按照引物合成回来以后引物管上标注的体积加对应的TE buffer溶解以后再用水稀释十倍的 （取10ul到另一个新的1.5ml离心管再加90ul无酶水） ！  这样浓度还大的话该怎么稀释呢？你们一般都是怎么稀释引物呢？

云飘过的思念

$ ^: d* r9 i7 E4 @7 K! W  ^' ?3 }8 D6 c6 G" E" E7 j* a3 f
回复 gxbzjznn 的帖子
- R" Q( I" ~4 W  D  ~! T8 ^
  @* v& c! m+ _0 N- V' e  T恩，具体染料可以分很多种，只要能在特定波长激发光下发光即可，但是染色方法是胶染哈，嘿嘿

云飘过的思念

+ [% P7 {! w4 I* x2 g1 {5 I# M

gxbzjznn 发表于 2016-1-13 22:38 # U! j! A# N7 X  E. H3 `3 |# V+ e; I  i
回复 nichifanlema2 的帖子
# }2 `* X3 [. u' b. P: L+ w% x( w. n
我是按照引物合成回来以后引物管上标注的体积加对应的TE buffer溶解以后再用水 ...

, \1 b3 p+ K5 O' L& m* |* g( J
2 H; o! |8 V4 L- I4 r. E: o
我们之前溶解引物的方法如下，仅供参考
. h/ t( N1 a+ z/ @9 g& d; M实测浓度（ng/ul）=实测260值*33*稀释倍数
  U& Z6 r' M, P. T( a) ^实际浓度（uM）= 实测浓度（ng/ul）*1000/M.W* F% e$ C8 p! e
补水量（ul）= 实际浓度（uM）*（总体积-测OD消耗体积）/定溶浓度（uM）- （总体积-测OD消耗体积）
# Q9 F% I  Z1 I2 d, s- ^
# `: F+ z' q/ l3 _定量设备为NanoDorp2000

nichifanlema2

回复 gxbzjznn 的帖子
$ V6 ~1 p0 y" ]; E) `; w
' @% U5 R8 h9 ^9 W引物二聚体的出现不一定会出现在每次扩增和其它基因的扩增中，其跟引物的设计有关。个人认为，在基因扩增时，引物的都是过量的，如果两对引物直接有4个（含）以上的碱基配对，引物二聚体就常常会出现，在不影响基因扩增和表达趋势的情况下，可以忽略不计。通常使用时的引物浓度为10uM,如果引物二聚体较为明显，或者影响了扩增，可以适当降低引物浓度。另外，为了提高扩增效率和扩增时的特异性，可以提高退火温度。