打造一部冲向癌细胞的战车：肿瘤免疫疗法之CAR-T细胞疗法

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7 H& ]0 d. c: `9 _1 r9 u  A" b! G2016-03-11李娟 赛先生
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文/李娟
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人体的免疫系统是一个有着精兵强将、作战技术精湛的防御战队，帮助我们的身体抵抗入侵的外敌。它能识别细菌、真菌、寄生虫和病毒等外源生物携带的特异抗原分子，将其清除消灭。然而，源于基因突变所致的细胞癌变，是一种内源性疾病，虽然肿瘤细胞也有抗原性，但在面对这类自身内部不可控的细胞增殖时，免疫系统通常无法作出有效的应答，其功力无法发挥，不足以杀死癌细胞。而且，癌细胞有多种主动对抗免疫系统的手段，它能成功逃避免疫监视，关闭免疫应答，抑制免疫系统的功能，最终导致癌症的发生或恶化。于是，当面对癌症这个劲敌时，如何驾驭免疫细胞的功能，增强免疫反应，解除免疫抑制，恢复免疫系统的作战力从而遏制癌症，是肿瘤免疫学家和医生面临的重大挑战。. u( ~% P5 [4 `! g7 ?' o

正确认识现行的肿瘤免疫疗法
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近些年，随着我们对免疫系统认识不断深入，利用免疫系统的不同组分治疗癌症的免疫疗法（immune therapy）的研究取得了重大突破，目前已有一些相关药物通过了美国食品药品管理局（FDA）的审核并在临床中使用。例如，用抗体治疗乳腺癌、黑色素瘤、淋巴癌、急慢性白血病等；用癌疫苗治疗前列腺癌；用干扰素和白介素2等细胞因子增强广泛的免疫应答；多个免疫检查点（checkpoint）的抑制剂也已被找到。与正在试验阶段的肿瘤免疫疗法一样，虽然上述疗法在临床中被证明有效，在使用其进行治疗的过程中，医生们仍然保持高度谨慎的态度，因为这些疗法或药物并不适用于所有类型的癌症，同类癌症病人的癌变体征又多有不同，常见的副作用也不容忽视。7 w# F( K; Z2 n! n
多个正在临床试验阶段的免疫疗法也取得了令人瞩目的成绩。这些疗法因为较多直接使用异体或病人自体的免疫细胞来治疗，又被称为免疫细胞疗法(immune cell therapy)。比如在体外培养专门攻击癌细胞的自然杀伤细胞（Natural killer cells），使其大量扩增并成熟之后，再回输到病人体内去消灭肿瘤细胞；通过分离并体外培养肿瘤内部能够对细胞癌变作出应答的侵润淋巴细胞(Tumor infiltrating lymphocyte)，再回输病人体内对抗肿瘤细胞。在临床试验中，上述疗法的疗效有限，西方国家并没有将其推广。
% {" {( a" n* l$ w) LT细胞作为淋巴细胞的一种，在人体获得性免疫中发挥着至关重要的作用。成熟的T细胞能活化其他免疫细胞，调节免疫功能，识别特异的抗原并杀死受到感染的细胞或者癌细胞。T细胞回输疗法在处理病毒感染病例的实践中由来已久。回输瘤体侵润T细胞疗法在治疗黑色素瘤的临床试验中，证明了T细胞回输针对肿瘤抗原也有一定的疗效。如何增强T细胞识别肿瘤相关抗原的靶向性，提高效应T细胞的持久杀伤能力，克服肿瘤的免疫抑制微环境，是肿瘤免疫疗法需要解决的核心问题。尽管目前尚没有FDA通过的T细胞疗法，一系列的临床试验研究已如火如荼的展开并取得了鼓舞人心的进展。4 C4 c$ R( p% P' C! j0 Y

最新临床试验表明CAR-T细胞免疫疗法疗效显著
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基因工程技术的发展使得人为改造T细胞特性成为可能。2016年2月14日，来自美国科学促进会年会(AAAS 2016)的会议报告引起了世界范围的广泛关注。报告指出，将基因工程改造后的CAR-T细胞（Chimeric Antigen Receptor，嵌合抗原受体T细胞），过继回输给化疗失败的B细胞恶性肿瘤患者，能够有效杀伤癌细胞并抗击癌症。过继回输之后的T细胞，在病人体内以功能特征不同的T细胞亚群存在，对CAR-T细胞的增殖能力以及疗效的持久性会有影响。通过对不同T细胞进行筛选，只使用最适合基因改造和过继治疗的T细胞亚群，能大大减少T细胞的回输数量，并不减弱其清除癌细胞的能力，而且这部分T细胞的增殖动力学和毒性也较容易预测。: s! V) ^( s4 b$ k, U$ N2 E5 G* n

  y/ O" _4 C* a# @6 Z+ b3 i  d/ b图1 CAR-T细胞免疫疗法：1. 从病人血液中分离提取T细胞；2. 在实验室中对T细胞进行基因工程改造，使其能靶向癌细胞而非自体正常细胞；3. 体外培养改造后的细胞使其增殖；4. CAR-T细胞回输进病人体内，靶向识别并杀伤癌细胞。(图片来源：Guardian graphic)
- l2 L1 t( ~3 ~7 Y这一疗法在初步临床试验中取得了良好的疗效。经过CAR-T细胞治疗后，超过50%的淋巴瘤患者进入缓解期，超过80%的非霍奇金淋巴瘤患者的临床症状减弱，94%的急性淋巴母细胞白血病患者的临床症状完全缓解。由此看来，B细胞肿瘤患者对该疗法的应答率非常高。因这类T细胞能在病人体内增殖，其疗效相对较持久，从而延长了病患的生存期。
6 ~, I: }% A% ~6 t0 R2 W3 UCAR-T细胞免疫疗法代表着当今最先进的肿瘤免疫细胞治疗技术，基于相关临床试验的成功，该领域已成为药品研发最热门的领域之一，也是投资合作的大热点。那么，CAR-T细胞是怎样改造的？影响CAR-T细胞发挥作用的因素有哪些？如何在保证疗效的基础上减少CAR-T细胞疗法的副作用？该疗法面临哪些挑战，有哪些方案可以解决呢？
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揭开CAR-T细胞的神秘面纱7 B  B) m9 X1 Y

CAR-T细胞疗法是结合了细胞治疗、基因治疗和免疫治疗的综合疗法。通过使用病毒载体，将肿瘤特定抗原DNA序列引入T细胞基因组中，在T细胞表面表达合成的或嵌合的特异受体（CAR）。该受体能够识别癌细胞表面的抗原分子，完成T细胞对逃避免疫监视的癌细胞的杀伤（图2）。在治疗B细胞肿瘤的临床试验中，嵌合抗原受体靶向结合的是B细胞表面分子CD19。3 ^# Q% j% X9 x% X, n
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图2 打造更优秀的T细胞（图片来源：LUCY READING-IKKANDA）7 H7 J# A9 h) l" ]$ B2 s
Zelig Eshhar 和 Steven Rosenberg 构建了第一代 CAR-T 细胞，他们设计的受体分子包括胞外抗体部分、跨膜结构，和胞内协同刺激信号转导结构。其中抗体部分能够靶向识别并结合癌细胞表面的特异抗原，胞内的共刺激信号转导域通过放大活性信号，激活并增强T细胞的杀伤能力。第二代和第三代CAR-T细胞增加了不同的协同刺激信号结构域，增加了能够增强靶向特异性、减弱副作用的第二个T细胞基因工程受体（图3）。简单来说，这类人造受体分子一半是单克隆抗体，一半是T细胞受体，也因此被称为嵌合抗原受体（CAR）。它结合了抗体的特异性和效应T细胞的杀伤功能，用抗体去靶向癌细胞，用T细胞去杀死癌细胞。- N8 d; o2 _: K

3 p/ }% G* ^6 L( {图3 CAR-T细胞的改造技术在不断进步（图片来源：LUCY READING-IKKANDA）
  q1 J% \; h0 t# a+ n3 ]% M: O除了拥有更高的靶向特异性之外，相比于之前的T细胞疗法，CAR-T细胞疗法还具有其他独特的优势。这类改造后的T细胞因为有嵌合抗体组分识别肿瘤抗原，不同于传统激活T细胞需要依赖MHC （majorhistocompatibility complex，主要组织相容性复合体）递呈抗原，因而能够克服肿瘤细胞通过下调MHC降低抗原递呈而介导的免疫逃逸。另外，CAR-T细胞不依赖于不同个体的HLA（human leukocyte antigen，人类白细胞抗原，人类的主要组织相容性复合体），所以理论上不同类型的癌症病人能够适用同一种靶向分子CAR-T细胞，意味着该疗法有较广的应用范围。
4 x0 v! u3 `' L7 Z6 @此外，通过对CAR-T细胞的进一步改造，可使其表达特定细胞因子，来帮助克服肿瘤免疫抑制微环境。这样CAR-T细胞不仅能直接杀伤癌细胞，还能通过细胞因子来调控其他免疫细胞的功能，从而在恶劣的微环境中保护免疫细胞。4 s7 `, c. b! _

CAR-T细胞疗法面临的挑战
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目前，CAR-T细胞疗法取得的成功无可置疑，但该领域的研究仍面临很大挑战。主要集中在两个方面，第一，安全性问题，即如何减少副作用，增强靶向特异性。第二，治疗实体肿瘤，即如何控制CAR-T细胞打入实体瘤内部并发挥杀伤作用。
/ @7 f! o; F" Q" q7 y, z6 B在用CD19 CAR-T细胞疗法治疗B细胞肿瘤时，因正常的B细胞也有CD19表达，其正常的再生发育会受到损伤，导致B细胞发育不全，这是CD19 CAR-T细胞治疗长期伴随的副作用之一。与其他免疫疗法相比，CAR-T细胞疗法起效较快，过度的免疫应答或不可避免地释放大量炎性细胞因子，引起细胞因子风暴（cytokine storm），导致高热、寒颤、呕吐腹泻或低血压等症状出现。如何适时地清除体内回输的CAR-T细胞，减弱其毒性，减少副作用，是急需解决的关键问题之一。
; Z! E/ y2 U, H8 ?1 K& b本年度AAAS的年会的报告指出，构建缺少信号转导组分的EGFRt（上皮细胞生长因子受体截短体）载体，引入T细胞中与CAR共表达，由于该EGFRt不能结合EGFR配体，不具备免疫原性，但仍然能够结合EGFR特异的抗体药物，故可以用药物来控制CAR-T的功能。动物体内实验结果证明，共表达EGFRt的T细胞能被EGFR特异抗体药物清除，减少了CAR-T的毒性，恢复了B细胞的正常发育。另外，引入iCasp9自杀基因来清除CAR-T细胞，在临床前试验中也被证明是可行的。使用表达iCasp9基因的CAR-T细胞治疗肉瘤或神经母细胞瘤的临床试验目前正在进行。
- {8 x3 y$ b( L因肿瘤特异性的单一靶抗原较少，靶抗原在其它组织细胞中也存在时（尤其是神经细胞、肺上皮细胞或心肌细胞），CAR-T细胞疗法就会引发危及生命的不良反应。寻找合适的肿瘤特异抗原，明确致癌突变，是CAR-T细胞疗法发展的基础。此外，提高T细胞靶向杀伤精准性和特异性的另一种方案，是使用双嵌合受体T细胞，只能识别并杀死两个抗原同时表达的癌细胞。或者设计引入另一个人工受体来调控CAR的表达，避开对正常细胞的攻击。2016年2月11日发表在《Cell》的两篇文章用小鼠实验证实了这个方案是有效的。
# S3 V" v7 g5 ~; }9 yCAR-T细胞可以在血液里游走，直接接触并杀死血液肿瘤细胞，与之不同的是，实体瘤复杂的微环境像一个屏障阻碍了T细胞的进入，这也是该疗法治疗实体瘤难以起效的根本原因，并且实体瘤的异质性特征也是不容忽视的问题。目前，全球有几十个治疗实体瘤的临床试验正在进行，涉及乳腺癌、神经胶质瘤、肝癌和胰腺癌等。改善瘤体免疫抑制微环境，筛选并明确靶抗原，把握安全剂量等，是实体瘤治疗领域急需解决的问题。3 |% M" @* g0 A/ T3 a( W2 R
CAR-T细胞疗法带有很强的精准医学、个性医疗的特征，T细胞的体外基因工程改造以及扩增培养也需要较长的时间，这些因素使得该疗法难以大规模快速的应用。采用健康的异体细胞作为来源以实现规模化生产，或可成为该问题的解决办法之一。但同时，如何避免异体之间的抗宿主反应，如何保护过继回输的CAR-T细胞不被杀伤，又是该领域的新的研究方向。! n0 v+ K) ~6 O, `) y. x' K+ S
即使困难重重，仍然不影响CAR-T细胞疗法良好的发展前景。相信会有越来越多的研究成果出现，为CAR-T细胞疗法的推广应用奠定基础。目前国内也有多个相关临床试验在开展，随着各项资金的大量投入，尤其是在治疗群体较大的实体瘤病例的研究中，中国或可取得更大的成果。作为肿瘤免疫治疗技术中的一部装备精良、战斗力十足的战车，相信在不远的将来，CAR-T细胞疗法能实现新的突破，开创肿瘤治疗的新世界。
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参考文献
& V$ b& D8 d7 T9 y; t; P8 ~+ }' i; |) b& g7 {% c/ ]
1 Engineering T Cells for Safe and Effective Cancer Immunotherapy.（AAAS 2016 annualmeeting）https://aaas.confex.com/aaas/2016/webprogram/Paper16827.html
) R5 G- Q% q9 y# _. M% E4 J+ s! a9 Z2 Advanced Clinical Cell Processing Technologies for Adoptive T Cell Therapy.（AAAS 2016 annualmeeting）https://aaas.confex.com/aaas/2016/webprogram/Paper16829.html
5 q  Q2 ~4 Q% x" q# r4 K3 The CAR T-Cell race. http://www.the-scientist.com/?ar ... he-CAR-T-Cell-Race/
: E  s8 W* }0 b) B$ o4 Cancer researchers claim 'extraordinary results' using T-cell therapy. https://www.theguardian.com/scie ... rch-clinical-trials+ }/ O$ H* l" u( S; C
5 Cancer Breakthrough: New T-Cell Therapy Produces ‘Extraordinary’ Results In Terminal Blood Cancer Patients. http://www.medicaldaily.com/canc ... rminally-ill-373697' y/ }2 P, v; `2 x" ]/ s
6 Precision tumor recognition by T Cells with combinatorial antigen-sensing circuits. CELL 164 (4): p770-779 (2016)9 I. ~, N6 o5 k4 j6 g
7 Engineering customized cell sensing and response behaviors using synthetic Notch receptors. CELL 164(4): p780-791 (2016)
* G4 A3 |5 k' d$ u8 Genetically modified T cells in cancer therapy: opportunities and challenges. Disease Models and Mechanisms8:337-350(2015): T" M) N. V& m+ |/ G
9 Prospects for gene-engineered T cell immunotherapy for solid cancers. Nature Medicine22,26–36 (2016)
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