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细胞复苏：
9 B0 ^/ D4 \( U+ V* v( x1 Q1. 将新鲜培养基置于37℃水浴锅中回温，回温后喷以75%酒精并擦拭之，移入无菌操作台内。如配置：50mL完全培养基(含10%FBS，1%青链霉素双抗)
- L& H3 n% f& k& j. n% g44.5mL基础培养基 + 5mL FBS + 0.5mL青链霉素双抗。
4 ^, y% h! P% X" R% |1 s2. 戴防护手套后，自液氮罐中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，立即放入37℃水槽中快速解冻（避免冰晶重新结晶而造成细胞死亡），轻摇冷冻管使其在2分钟内全部融化，以75%酒精擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。2 v7 i% M# m# V
3. 将解冻的1mL细胞悬液缓缓加入细胞培养瓶内，再向瓶中加入10mL完全培养基(稀释比例为1:10)，混合均匀，放入37℃，5%CO2的恒温培养箱中培养。取0.1ml解冻细胞悬液作存活测试。(Sf9细胞在27℃生长，可不需CO2)
8 F7 k6 Y1 i* k" G+ a+ D4. 一般而言，细胞大都不需立即去除冷冻保护剂(例如DMSO)。若要立即去除，则将解冻的细胞悬液加入含有5-10ml培养基之离心管内，离心1300rpm，5分钟，移去上清液，加入新鲜培养基，混合均匀，放入CO2培养箱培养。若不需立即去除冷冻保存剂，则在解冻培养后隔日更换培养基。
' O- P1 N& z% y( ^+ K. {/ @$ ]传代培养：) t3 F' U' k. \ J* P
1. 37℃恒温培养约48小时，待细胞长满80-90%后，从培养箱取出75cm2培养瓶，倒掉培养基。加入5mLPBS缓冲液吹打以洗去残留血清，倒掉缓冲液。 ?4 f# j# ?2 j( r) _) J1 U
2. 沿壁（无细胞的一面）缓缓加入1mL胰酶溶液消化细胞约1min，轻轻摇晃，倒掉残余胰酶，将培养瓶置于恒温箱中约1min，拿出培养瓶轻轻拍打一下细胞贴壁的一面。
! `! H \; a2 \0 ]注意：最佳消化温度是37℃，加液后用移液管反复吹打分散细胞。7 \$ |/ ]( Q1 V/ f$ m8 j3 `5 w
3. 向瓶中加入5mL完全培养基，反复吹打均匀2min，从中取出20μl至0.5ml小离心管中，向管中加入80μl台盼蓝溶液，混匀，从混合液中取出10μl至盖好盖玻片的计数板上，计算细胞密度及活率。: z! t! `/ l' l6 Q5 p
4. 将5mL细胞悬液全部吸出，分别接种1mL悬液到原培养瓶和另一新的培养瓶中，其余舍弃。再向两瓶中各加入10mL完全培养基，置于CO2培养箱培养。（细胞传代时按1：5或更大比例稀释）
6 M) s# M# _; g! E, {% E2 d! ~细胞计数与存活测试：7 S6 h8 A7 L4 o! M# Z
1. 取10μl混合液自血球计数盘chamber上方凹槽加入，盖上盖玻片，于100倍倒立显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞则为蓝色。+ p/ t3 T) q) e. ^$ L
2. 计数四个大方格的细胞总数。计数板计数时，最适浓度为5～10×105细胞/ml。高浓度细胞悬液，可取出部分稀释后计数。 K: Q: t1 C s( Q
3. 每一大格的体积为0.1cm×0.1cm×0.01cm= 10-4ml。若细胞位于线上，只计左线与上线的细胞。
/ M% Z* e. L' m8 S7 o注：细胞密度= 四大格细胞总数×稀释倍数×104/4= 细胞数/ml；
+ ~9 q; T' D6 M* w# Q O细胞活率= 活细胞数/（活细胞数+死细胞数）×100%。
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发表于 2016-3-29 09:57
