新人请教脐带间充质干细胞的分离问题

seergene

最近做实验需要用到脐带间充质干细胞，试过酶消化法和贴壁法分离细胞。消化法用的Ⅱ型胶原酶消化4个小时，在上清液中分离出少量的细胞，但是状态非常差，只传了一代就开始老化了。贴壁法试过2次，培养10-14天左右都会有细胞爬出来，但是速度相当慢，继续培养10天左右细胞也没长满板底一半的面积，大部分爬出来的细胞持续呈圆形，只有很少一部分变成长梭形，并且细胞爬出的7天以后就开始有部分贴壁的圆形细胞脱落。我用的培养基是DMEM/F12，加10%FBS，加4万单位的庆大霉素。
2 I5 k0 C# V3 ]& [- T7 @; ^0 W请教哪位高手指点一下细胞的分离方法，消化法的话用那种酶消化，具体消化多长时间，然后收集细胞的时候是否过滤离心，离心的转速是多少？贴壁法的话，如何才能让细胞生长的快一些，大概多少天能收集到细胞？谢谢了！

Diane0321

昨天有位大神发给我的，一起学习
/ t% z$ |1 W# n. [( p(1)        无菌收集脐带：在超净台内将脐带浸泡于含有1%（v/v）庆大霉素的生理盐水中，除去脐带外表及内部残留的血液，洗净后将其剪成约2cm长度，用镊子撕开羊膜（最好从两根动脉之间）一次剔除两根动脉，一根静脉，再用有齿镊子提起胶体，顺脐带轴方向剪成细长条状，再剪成1-3mm小块；
! ?0 |/ j' Z# {$ `(2)         酶消化法：消化前将组织块用生理盐水冲洗两遍，剪成肉泥状，转移到50ml离心管中，加入消化液（组织：消化液=5:3体积比），混匀，37℃中消化2h，每隔30min振摇一次。加入10倍体积的生理盐水稀释，500r离心3min，取上清液，然后将上清液用2500r，离心10min，取沉淀，将沉淀用Cayden（10%FBS）重悬，将混悬液加入六孔板中，37℃，5%CO2培养箱中培养，次日能在显微镜下观察到贴壁细胞，半量换液后继续培养，3d后换液，细胞能够稳定生长。每三天换液一次，至细胞生长铺满瓶底，即可进行传代。
3 Y& ^' a6 {. |' X5 G2 ?( s" Z(3)         组织块培养法：将剪碎的组织块均匀铺于六孔板中，间隔1-3mm即可，倒置六孔板中，放入孵箱1.5h左右取出，见组织块已经粘附在培养皿底部，延边缘缓缓加入培养基，注意一定不要将组织块冲起，要让培养基逐渐蔓延整个培养体系，放入培养箱，3d后上镜看，如果有细胞沿组织块边缘出现后可以间隔3天换液了，等到组织块周围细胞呈集落生长，可以传代了。
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晗晗

需要离心的1000转  5分钟就行啦 4 m  @3 f+ X# s- W" [/ B
组织块的话得一周吧

flylover1221

细胞呈卵圆形，是不是血管没有剔除干净，长出的内皮细胞？
2 ~: }: U/ E* k' W6 K5 J4 ^我用的酶消化法是1500rpm,离心6min,需要过滤。但是滤网上的残渣，我也会用培养基冲下来，可以培养出细胞；, t& R) g8 ], z3 @( A. g. m
贴壁法在于你的组织块是不剪得很均匀，换液时培养基不能加的太猛。一般是5-7天看到细胞爬出，两周左右就可以传代了。

deshenglll

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用组织块法就很好。消化的方法太麻烦，效果也不是很好。还有就是可以不用加抗生素的。

meredith603

你只用胶原酶消化是不够的，肯定要加上透明质酸酶等其他温和的酶，消化时间可以长达15-20个小时，不然光是组织块里面的胶原就足够让你的细胞分离不出来。

田甜

组织块法是比较好的方法，但是原代培养时，不需要细胞长满瓶底，那样就会造成细胞克隆团局部过满，细胞状态会变差。个人认为，一个皿子里有四到五个较大克隆团时就传代，细胞传代后生长状态都会不错，你可以试试。

kangjian1009111

回复 田甜 的帖子4 \4 j+ O) {/ [4 k" A( M
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组织块法大概几天可以有细胞爬出

bin

回复 晗晗 的帖子2 T" R2 q! ^- e' C* i

7 M% v5 K* K$ Q/ x2 p) D消化的细胞1000转是离不下来的，要2000转离10分钟。

bin

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  T  ~. s1 @8 Y) Y, M' l6 F$ @2 W+ P
组织块法爬出的时间因组织而异的，我做过最快的5天爬出来，最慢的要一个月，我还是推荐酶消化的方法。