细胞细化成网状、很难消化成单细胞悬液问题求助？

gxbzjznn

最近在做小鼠的间充质干细胞培养，在做传代培养及下一步生长曲线绘制和MTT实验发现贴壁培养的P3代细胞很难消化成单细胞悬液，基本上一消化就成了网状或者片状？请各路大神帮忙指点是什么原因？用的是0.25的胰蛋白酶！情况分别如下图所示，图1：未加胰酶消化的细胞状态图， 图2：刚加入胰酶的细胞状态图，图3：是消化两分钟的样子，图4：消化两分钟后时间再长一点就变成这样了 图5：细胞离心重悬得到的悬液
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lgfffancy

你这个问题很简单，你没培养细胞多久吧。胰酶消化下来之后，加medium中和胰酶，4 V/ d( ^0 F; B: o' h/ e' y8 f
反复吹打，使其成为单细胞悬液。' i4 {- X4 J" d8 U) G2 z# B
至于不加胰酶消化，我没有用过，一般消化都需要加胰酶的。

gxbzjznn

回复 lgfffancy 的帖子2 B: u9 h! V0 c
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你好像误解了我的意思 图1是正常培养的贴壁细胞没有加胰酶 也没对它进行消化  还有我养细胞好几年了  这个情况是我一个朋友遇到的 我帮她发帖求助的 （加medium中和胰酶 反复吹打已经做了啊 仍然还是网状 片状）你估计没理解我的意思  要是那么简单的话 我也不会发帖求助了

lgfffancy

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小鼠msc我也养了很久，也是自己分的。
+ B. F) C% {0 d, q$ M  _' r如果她遇到这个问题，我觉得可能是她操作手法的问题，2 e. @7 G" t" j- S$ _; Z( {
你可以帮她亲自试试，说不定问题就解决了。

gxbzjznn

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% P9 R3 c! E- ~7 W; V7 n" v' o第一次是老师分的 老师也消化了，也出现了这个结果" [: Z/ \2 M( z& ?( h4 y& ]
她以前在其他实验室也做过细胞，从来没有出过这个问题3 g3 ?! r9 A3 S3 n& h) ]8 V
应该不是手法的问题: b( g4 K. ~% i" A9 t% B) z

444352110@qq

可以试一下温和消化液，那样可能会好一点吧

pauldong

这种情况很常见，第一细胞生长时间是否比较长，第二消化前是否冲洗一遍去除原培养液并弃尽，第三胰酶浓度是否合适（我们用过0.125%和0.05%的），第四胰酶是否复温，第五可以试着加入胰酶后盖好放到培养箱里消化两分钟，可能效果更好些。
: _5 W- R1 X' F; L' R2 z  R% J如果这些都不能解决问题，就要鉴定下细胞纯度了，也许掺杂了许多内皮细胞或者别的细胞，一般MSC还是比较好消化的

lgfffancy

回复 pauldong 的帖子' B! @+ P" P6 L& ]' Y

$ i0 |: z: }* G0 L0 O7 Q我很赞同你的意见，如果这样还不行，那可能是MSC已经变了质。

yooung

你试一试我这种方法，即加入胰酶就轻摇培养瓶使胰酶漫过全部细胞，立即轻拍培养瓶，边拍边摇，直到细胞全下来（消化两分钟内）。该方法的关键是胰酶加后立即轻拍，而不是消化两分钟之后再拍。你可以试一试该方法，看其效果怎么样。

gxbzjznn

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7 I- b$ F* ]  l$ j; A4 j: W: E/ N0 A2 O6 P恩 谢谢您 回头我试试