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发表于 2009-4-28 21:08 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

PTEN研究进入细胞核时代

Suzanne J. Baker! a; ]& ^& k0 o' l
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Cell, Vol. 128, 25-28, January 12, 2007
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我们对PTEN肿瘤抑制蛋白的调节的理解仍很匮乏。Wang等和Trotman等描述了遍在蛋白化如何调节PTEN的稳定性及其在细胞核中的定位。此外，Shen等报道了在细胞核中的PTEN可帮助维持染色体稳定性。
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PTEN（磷酸化酶和TENsin同源物）肿瘤抑制子是人类癌症中突变频率最高的基因之一。导致PTEN基因失活的体细胞突变存在于许多偶发性癌症中。生殖细胞的PTEN基因突变可引起遗传性患错构瘤和癌症的综合症—Cowden氏病。PTEN是磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)信号传导级联的关键负调节子。PI3激酶家族中的I类在受体酪氨酸激酶(RTK)或G蛋白偶联受体(GPCR)的下游激活，催化磷酸肌醇-4，5-磷酸(PIP2)转换成磷酸肌醇-3，4，5-磷酸(PIP3)，导致ATK激酶和其他下游效应子活化。PTEN是使位于质膜的PIP3脱磷酸化的脂磷酸酶，可抑制PI3K介导的生长、增殖和存活信号。PTEN除了在质膜信号传导中有确定的作用外，在不同的正常和肿瘤细胞的细胞核中也发现有PTEN的存在。令人感兴趣的是，PTEN在细胞核中的位置可能与其肿瘤抑制子活性有关。因为许多PI3K信号传导途径的主要组分也存在于细胞核，例如PIP2、PIP3、PI3K、PDKI和AKT，所以PTEN也可能是细胞核内的PIP3磷酸酶。然而，最近的一项研究指出，细胞核中的PTEN不对细胞核内的PIP3脱磷酸化。其他的研究指出，PTEN在细胞核中依赖于磷酸酶的功能还包括调节p53活性和稳定性的蛋白—蛋白相互作用。; m$ R+ Z- n0 y! z" w- C

本期Cell的三篇重要文章对遍在蛋白化在调节PTEN稳定性及其在细胞核中定位中的作用，以及对细胞核PTEN在染色体稳定性中的功能，作了深入观察。
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PTEN降解6 u" p3 \( o/ ~1 e6 U& C' q6 Y4 V/ C

PTEN含有两个PEST基序，这种基序常存在于被遍在蛋白途径降解的蛋白质中。Wang等研究了遍在蛋白介导的PTEN的降解。在证实了超量表达的PTEN在细胞中处于多聚遍在蛋白化状态之后，Wang等使用体外多聚遍在蛋白化测定鉴定了NEDD4-1（神经前体细胞表达的、发育下调的4-1）是E3遍在蛋白，可专一性使PTEN遍在蛋白化。NEDD4-1与PTEN有直接的物理相互作用，NEDD4-1的超量表达导致内源PTEN遍在蛋白化并被蛋白酶体降解。相反，在用RNAi对NEDD4-1进行剔除后，可使超量表达的PTEN水平和稳定性增加。" ?- e4 i5 N' {; `8 y" Y/ y) I7 [' k5 g

这些数据表明，NEDD4-1对由于PTEN肿瘤抑制活性受到抑制而引起的癌发生起某些作用。缺失p53的MEF可由于Pten基因的删除而被转化，但不会由于NEDD4-1的超量表达而被转化，这很可能是由于数量减少了的Pten蛋白质对肿瘤抑制仍是足够的。尽管NEDD4-1本身并不能引起癌症，但它的超量表达增加了Ras介导的、缺失p53的小鼠胚胎纤维细胞(MEF)的转化。重要的是这种影响并不存在于缺失Pten的细胞中，这说明NEDD4-1的致癌活性依赖于PTEN。
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为了评估NEDD4-1在生理学方面的作用，Wang等分析了前列腺癌的小鼠模型。在这个模型中，前列腺癌产生的起始和速度与Pten表达水平的下降直接相关。他们用免疫组织化学展示了在Pten水平降低的前列腺肿瘤病灶中，NEDD4-1的水平有所增加，这说明Nedd4-1水平的增加与癌症发生有关。此外，通过RNAi将Nedd4-1剔除后，可抑制表达PTEN的前列腺肿瘤细胞的异种移植生长，但对缺失PTEN的细胞系的生长无影响。4 O) J5 l& e, r4 p- `: W
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在各种情况中NEDD4-1可能都不具有致癌活性，因为它可能并没有使PTEN完全去除。在人肿瘤中，部分PTEN的失活是否可导致癌症发生？许多不同类型的偶发性肿瘤常有PTEN等位基因的删除，但保持有一个野生型等位基因。在这些肿瘤中，单个PTEN的缺失与癌症发生的关系尚不能确定。在许多入侵性人膀胱癌中，在高水平NEDD4-1信使RNA和PTEN蛋白水平下降之间有关联。然而，在NEDD4-1和PTEN之间没有相反的关联，这可以从NEDD4-1是PTEN稳态水平的主要调节物的模型中推断出。
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MDM2提供了一个通过遍在蛋白调节肿瘤抑制子的先例，它使p53遍在蛋白化，促使其降解。在肿瘤中MDM2可与p53一起扩增，这为MDM2可作为人肿瘤原癌基因提供了令人信服的遗传学证据。对NEDD4-1在原始肿瘤中扩增的鉴定，可提供这种遍在蛋白连接酶对人类有致癌活性的重要证据。NEDD4-1被怎样调节、NEDD4-1介导的遍在蛋白化引起的PTEN的大量丧失有那些组织和生理学背景、NEDD4-1介导的遍在蛋白化还可作用那些蛋白质、以及是否其他遍在蛋白连接酶也修饰PTEN等信息，可为NEDD4-1的抑制是否可成为有效治疗方法提供重要依据。

PTEN遍在蛋白化：具有重大实质意义
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Trotman等在本期Cell展示了NEDD4-1介导的PTEN遍在蛋白化的可能生理学后果相当复杂。他们研究了在Cowden综合症家族中鉴定的PTEN的赖氨酸到谷氨酸(K289E)的突变。早期的研究表明，这种突变并没有破坏PTEN突变蛋白的磷酸酶活性或在膜上的位置。来自Cowden患者的肠息肉带有遗传性K289E突变，并有野生型PTEN等位基因的删除，只表达突变的等位基因。Trotman等使用有这种生殖细胞突变的患者的肠息肉，展示了K289E突变蛋白已从发育异常的上皮细胞核中除去。他们进一步展示了超量表达的GFP-PTEN K289E融合蛋白主要位于细胞质，而野生型GFP-PTEN融合蛋白在细胞核和细胞质中都存在。PTEN的这种位置异常与PTEN磷酸酶活性无关，而是由于细胞核输入的极大降低（无细胞核输出的增加）。

上述作者表明NEDD4-1可以使PTEN的K289以及若干其他位点遍在蛋白化。尽管还没有在细胞中证实K289可专一性遍在蛋白化，但PTEN K289E的超量表达显示该突变导致PTEN单遍在蛋白化减少。PTEN的赖氨酸13是转染细胞中的第二个遍在蛋白化位点。最初发现于偶发性脑癌的赖氨酸13的突变K13E，也破坏PTEN的细胞核定位，减少其细胞核输入速度。遍在蛋白的超量表达增加PTEN的细胞核输入速度。只能进行单遍在蛋白化的突变遍在蛋白的超量表达导致PTEN细胞核输入速度大幅度增加。& y4 w  _: s# L& c$ c% x
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这项研究显示细胞核PTEN随着遍在蛋白化，特别是单遍在蛋白化有大幅度增加。然而，与PTEN无关的其他底物的遍在蛋白化也可能造成这种影响。上述作者进一步在存在或缺失NEDD4-1的情况中对PTEN的定位进行评估。NEDD4-1的剔除使PTEN重新回到细胞质，而NEDD4-1的超量表达可增加PTEN在细胞核中定位。在细胞核中富集单遍在蛋白化的PTEN，然而，细胞核PTEN的总体并不是单遍在蛋白化的。这说明在细胞核中PTEN的单遍在蛋白被除去，或输入了一部分没有遍在蛋白化的细胞核PTEN。很清楚，对细胞中使PTEN脱遍在蛋白的酶的鉴定，会推导出在另一种水平上对PTEN稳定性和定位的调节。
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有趣的是，MDM2介导的p53的遍在蛋白化增加其细胞核输出和细胞质降解。相反，单遍在蛋白化使PTEN转运到细胞核，增加PTEN的稳定性，而NEDD4-1介导的PTEN的遍在蛋白化增加PTEN的降解。这两种相反的结果是由控制遍在蛋白化过程来调节吗？测定遍在蛋白化与以前鉴定的PTEN转换和定位的机制是否有协同作用特别令人感兴趣。例如，C末端尾的磷酸化影响PTEN的稳定性，尽管影响这个过程的生理刺激还不清楚。含有K289突变的PTEN可从细胞核中逐出，这可能是由于该赖氨酸的遍在蛋白化下降。然而，如同若干缺少K289的PTEN C末端缺失突变体的细胞核和细胞质定位所显示的，K289的单遍在蛋白化不是PTEN细胞核输入所必需的。已有人描述了几种不同的PTEN细胞核输入调节模型，其中包括由扩散引起的被动运输、由PTEN C末端的细胞核定位信号引起的主动运输、由N末端细胞核定位结构域以及多种细胞核排出基序介导的依赖于Ran的输入。单遍在蛋白化可能通过某些上述机制，或通过单一途径，为增加通往细胞核的运输提供信号。
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PTEN和基因组完整性' ?" m% i# k/ V4 ]2 M$ U- P. Q
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   PTEN的细胞核定位如何影响肿瘤抑制？前期研究表明PTEN的丢失会导致基因组不稳定，这是由导致激酶CHKI封闭增加的细胞质信号传导途径引起的（AKT介导CHKI封闭），因此在对DNA损伤起响应时，会损害G2/S期关卡。Shen等在本期Cell发表的文章研究了PTEN缺失与非整倍单倍体之间的关系。他们的研究表明，与野生型MEF相比，缺失Pten的MEF的染色体片段数目增加，在中心粒和染色单体中有断裂以及有交互易位。染色体不稳定性的频率在Pten缺失的胚胎干细胞中比在MEF中要低得多，这说明Pten在基因组不稳定性中的作用随着细胞类型的不同而有所不同。在MEF细胞核中的内源Pten与中心粒处于相同位置。Pten可与核心中心粒蛋白Cenp-C一起免疫沉淀，Cenp-C是动粒正确组装以及在减数分裂中间期向末期转换所必需的。$ \) D3 [4 p, B

Shen等使用最早在Cowden综合症患者中鉴定的PTEN突变，展示了PTEN的C末端（非磷酸酶结构域）是PTEN与Cenp-C和中心粒相互作用所必需的。在野生型细胞中，C末端截断的PTEN的表达阻止内源野生型Pten与Cenp-C的结合，使染色体发生异常，但对磷酸Akt的水平无影响。这说明缺少C末端的突变PTEN的表达可干扰PTEN在中心粒的正常功能，但不影响PTEN的细胞质活性。需要有机理方面的实验来测定PTEN相互作用是否和如何影响动粒组合中CENP-C的功能或间期向末期的转换。

在缺失Pten 的MEF中观察到的染色单体断裂和易位表明DNA损伤修复机制有潜在损伤。Shen等确实发现在缺失Pten的MEF细胞核中，具有磷酸化的组蛋白H2AX和p53结合蛋白1[这二者都与DNA双链断裂点(DSB)结合]的位点增加。这与早些时候有关通过RNAi剔除PTEN后，细胞核中含有磷酸化H2AX的位点增加的报道一致。在Pten缺失的MEF中，有关DNA DSB修复基因表达变化的研究鉴定出Rad51 mRNA和蛋白质都有大幅度减少。Rad51是同源重组和DNA DSB修复的必要组分。在缺失Pten的MEF中强行表达Rad51可使DSB降低到野生型MEF的水平，这表明在Rad51缺失和DSB之间有功能联系。与之相似的是，缺失PTEN的前列腺癌细胞系PC-3极少表达RAD51；PTEN的外源性表达诱导RAD51，使这些细胞中的DNA DSB减少。
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在PTEN缺失和Rad51转录调节之间有某种关联是意料之外的。已知PTEN可通过抑制AKT介导的磷酸化和封闭转录因子FOXO家族来影响转录。这需要PTEN的磷酸酶活性并可能需要细胞质和细胞核PTEN的参与。Shen等提出PTEN对转录调节有直接影响，因为他们通过染色质IP(ChIP)测定，发现Pten与Rad51启动子结合。由于PTEN可能有某些不同的功能，证实PTEN与DNA的结合有序列专一性尤为重要，因为PTEN与DNA的非专一性结合在ChIP测定中也能产生相同结果。尽管PTEN不能直接活化Rad51启动子报告构建物的转录，但PTEN的表达可增加E2F介导的该构建物的反式活化。PTEN的超量表达可影响培养中的细胞的细胞周期调节，其结果会由于细胞系和外源表达水平的不同而变化。在Rad51启动子活化中，E2F介导的变化可能是PTEN介导的细胞周期影响的间接结果。Shen等假定Pten可能通过影响Rad51启动子染色质重建，与E2F介导的Rad51转录协同作用。这种机制不能解释当DNA报告构建物缺少组蛋白时，Pten在过渡性转染测定中的影响。然而，在PTEN和染色质重建之间可能有关联。最近的研究表明，在PTEN和转录辅激活物PCAF和p300（它们有组蛋白乙酰转移酶功能）之间存在相互作用。这些相互作用产生的复杂功能影响超出了组蛋白乙酰化，因为PCAF介导的PTEN乙酰化可调节PTEN磷酸酶活性，在PTEN和p53之间的相互作用可刺激p300介导的p53乙酰化。
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结束语- W( U+ E9 o: |4 i) w' R% F0 z

总而言之，在本期Cell上的三篇文章提出了若干有关PTEN调节和肿瘤抑制的重要问题。调节PTEN稳定性、活性和位置的生理学信号是什么？何时和怎样才能破坏这种与肿瘤生成有关的调节？相对于作为调节PI3K信号传导的细胞质脂磷酸酶的PTEN而言，细胞核中的PTEN和基因组稳定性对肿瘤抑制起什么作用？PTEN的全部功能是否在任何方面对肿瘤抑制都是重要的？是否不同的PTEN活性在特定的致癌过程中起不同作用？/ T3 [8 S9 t( B6 X; i
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PTEN参与若干与肿瘤生成有关的细胞过程，包括增殖和存活的调节、细胞迁移和入侵、基因组稳定性、在响应DNA损伤时细胞周期关卡的诱导以及干细胞自我更新。PTEN的各种各样的活性分布在细胞核和细胞质中。许多功能（不是全部）需要有直接调节PIP3水平的PTEN的脂磷酸酶活性。在有磷酸酶选择性失活的的点突变的肿瘤中，PTEN中与磷酸酶无关的活性仍是完整的，因而与这些肿瘤无关。Shen等和Trotman等的研究使用了在Cowden综合症患者中发现的罕见突变。这些突变保留了PTEN的磷酸酶结构域，但是在C末端有删除或有关键氨基酸的突变。对这些突变的分析导致了对先前未曾鉴定的PTEN功能的新发现。遍在蛋白介导的PTEN稳定性和细胞核定位的调节，以及PTEN在染色质稳定性中的作用是否与缺失PTEN活性的各种肿瘤有关？在这些研究中测定的Cowden综合症突变相当罕见，所以不可能用患者信息来判定这些突变是否可引起与PTEN缺失有关的各种疾病。不同的PTEN功能可能是不同组织中的肿瘤抑制所必需的，不同的功能对不同致癌刺激起响应。含有C末端关键氨基酸残基的knockin突变的小鼠模型可帮助测定是否在所有组织中可观察到对定位和对染色体稳定性的影响，以及是否与在Pten杂合子或条件剔除小鼠中研究的PTEN失效突变肿瘤类似。对在特定肿瘤中所涉及的特定PTEN途径以及对影响和调节这些功能的细胞因子的理解，可为开发和使用这些途径抑制剂成功治疗癌症提供必要基础。

本文转自建人先生原创，感谢

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