请问电转后加药筛选细胞不死有哪些原因，还是可以默认为100%的转染率，谢谢！

Yedan

Puro浓度太低了，一般用的是0.5-1ug/ml。

缥飘实验员

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. E7 b( m' ?8 F" h1 N: `: g0 Z: d5 |. d' h: O
理论上在药物筛选过后，所有细胞都是阳性的，但是我需要建立一个稳定整合的细胞系，必须做单克隆，和veda327 的意见一样。文献上也有直接药筛收获细胞用于实验

缥飘实验员

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/ B. z9 i8 U! ~$ P2 Y& }( K: n& g) l5 J( f% L, B6 a5 r' U
但是用野生型的细胞 0.25 三天死亡，0.5、0.75、0.1都是24h全挂了，文献的差距也大，估计是细胞的敏感度不一样吧。

缥飘实验员

回复 Yedan 的帖子! I5 L* {& R% h0 R) _0 H$ ^4 G1 @

+ x6 I" i0 ?7 L  `) w请问有这样的实验经历么，现在是H1 细胞，谢谢

Yedan

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2 h  b4 @% y" B9 v
2 m+ L! D7 ?# r8 A4 ~8 ^+ ^电转效率不高的时候，0.5ug/ml处理24h死很多是很正常的事，你降低浓度拉长时间反而对细胞的核型有影响。

缥飘实验员

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9 {* C% I# Z1 F0 {( {现在得到的野生型数据是0.25u g／ml 3 天致死，0.5 往后一天就挂了，我是按 3乘以10的5 次方 每孔（6孔板）接种48h加药致细胞全部死亡，包括边缘细胞［h1 的边缘效应很明显］，来获取工作浓度。我在重复一下，反正也快，还请指点一下，关于药物浓度的筛选，谢谢

yinchong42

回复 veda327 的帖子( H* O  t& a/ E8 n$ g/ _: q

) P* n' ~) [& |& B* E- T# X好的，非常感谢！

Yedan

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) l( e* o% G; E( n: q. Z4 y8 k1 c2 D/ ~
我不是一开始就说了么……常用的浓度是0.5-1 ug/ml。这个浓度对WT的细胞来说就是加药后一天就会死很多，处理48h就够了。

缥飘实验员

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9 B9 z- |; ~+ D: D& X7 ~thanks 谢谢耐心回复，明白了

缥飘实验员

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/ G5 ^3 o3 A1 ]1 M. S/ {- T
- M9 l% W: a2 A* \) C; h您好，为什么时间长了会对核型有影响呢，查了相关文献，还未找到具体的数据，再次谢谢