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碱性磷酸酶（ALP）是成熟成骨细胞的标志性酶，同时成骨细胞形成的钙结节也是成骨细胞的标记物。
1 @+ U7 v: T, G1 l
& U& d! [, D" o5 y8 {& Z以ALP为目标物的检测方法：0 |) a6 {: E( L
4 E$ z. S o: T6 Q
) ?* o3 @5 e# q! _* J9 ^* _3 z
7 ~' }; n* T/ F
1 Gomori钙钴法
( {" Y. ^5 b2 Z% ?- q) U【染色原理】 Z& O3 l+ i5 {# A( h0 k9 _2 h
; r* p y" x8 m& kALP在pH值9.4的环境下，以镁离子作为激活剂，能够把β-甘油磷酸钠水解出磷酸，磷酸与高浓度的钙盐结合形成无色的磷酸钙，再与硝酸钴作用形成磷酸钴，经硫化胺处理形成黑色的硫化钴沉淀在酶活性处。
( T; `! _) ~; a- z: k. V: }【孵育液配制】
$ [% t0 n1 ]" Y, N( ~' m, a; e, Z2 K8 _& a8 N5 M0 F
3%β-甘油磷酸钠5ml
3 m% N1 r- A( G* `9 J% ^2%巴比妥钠5ml$ q+ F- o+ Y' G. i3 e
蒸馏水10ml
) n% X9 }% ^% f7 O! y. P5 W2% CaCl2 10ml: G+ v9 T( _1 e' O! }' b
2% MgSO4 1ml
* C( p- j- B4 E/ S/ @【步骤】
% L3 Z. x0 Q- L! h6 P& }0 Q3 K: ~（1）将无菌的玻片放入培养皿中，传代时加入适量的细胞悬液，作细胞爬片，呆细胞长满玻片后取出。
. z3 a% |. W3 u, K3 _. T3 @: G（2）PBS冲洗后用冷丙醇固定10min，蒸馏水冲洗数次。
; O% I$ }3 t i& ?) Z（3）入孵育液中，37℃孵育4-6h。自来水冲洗数次。
R9 [! i' z* C) c! u（4）2%硝酸钴中浸3-5min，蒸馏水洗数次。
& E5 l. Y5 V0 E. b（5）1%的硫化铵中2min，自来水冲洗，自然干燥，封固。
y: C o5 Y+ V% R7 D; x4 r2 L【结果】胞质中阳性反应呈现灰黑色颗粒或块状沉淀。2 I# ?5 O4 R2 P# I5 E
0 Q$ W& d3 C6 M1 @5 ~7 X0 Z9 ?& X
2 偶氮偶联法：( o. n% b. b+ x. B4 Y K' U- r2 E
【孵育液配制】 % C% J' p# h2 q( l% C. b; R* T, g
9 L3 R, B* w$ Q) i7 ^- G. Z5 T
萘酚AS-BI磷酸盐 20mg
# y+ y6 q: I6 H0 w9 L# S9 ^' H; nDMSO 0.5ml
- S7 _0 y. Q: U0 Q! c0.2mol/L巴比妥醋酸缓冲液（PH 9.2） 50ml
/ e- V3 @: k- j& K; Q8 `5 c六偶氮副品红0.5ml
& b; B% r2 Y: k' I2 k' F1mol/L NaOH调PH 9-10，混合后过滤使用。2 q a! m: X( {- Z4 q. P2 h
（六偶氮副品红：副品红400mg，浓盐酸2ml，双蒸水8ml混合过滤；临用前与等体积4%亚硝酸钠混合）: i2 ]: p7 i" y1 e+ E
【步骤】
) N& J. Z Z+ L) X( y6 O（1）细胞爬片成功后，PBS冲洗后，置入4℃10%甲醛固定10min。
+ Z! Z3 [! n/ t& }（2）蒸馏水冲洗。; Z. m0 y( h3 e5 I# W
（3）将过滤孵液直接滴加于玻片上，室温下作用45min。$ \1 I# r/ G! o1 P$ r1 W |2 `
（4）流水冲洗，晾干。' i) J; ~( E- y
（5）甘油明胶封固。) F# p/ _5 D$ t' |% A
【结果】成骨细胞胞质中可见红色ALP阳性颗粒。& }# n+ V8 g1 p. q, B5 @& Y( H$ q
& m+ q8 R5 ~; U* N6 L7 e' M
' _! ]+ H- g7 A3 碱性磷酸酶染色试剂盒法：
" g( ?7 R, U, u& n【作用原理】 细胞内碱性磷酸酶在Ph9.4-9.6条件下水解磷酸萘酚AS-MX产生萘酚，后者被重氮盐捕获，生成不溶性有色沉淀。
& x! r, w& l4 t6 p# l【作用液配制】5 k$ U; w7 |+ E$ q1 e" i' j) M
4 h; h: `' b' v
取2号储备液10ml，加3号液200ul，再加4号粉剂10mg，振摇速溶，立即过滤到细胞爬片上。- l# X1 R K8 K% P
【步骤】1 m' `8 ]* c, |% o- @* Z7 k
（1）细胞爬片滴加数滴1号液，室温固定一分钟（不可以延长），流水漂洗2分，晾干。' t+ f: g, e; n4 \/ A( j
（2）滴加作用液数滴，置湿盒内于37℃孵育2小时，流水冲洗2分钟。
7 g1 J' b! B$ p3 v8 _( M f5 B（3）滴加5号液数滴，复染5分钟，流水冲洗2分钟，晾干。
4 A" n( W5 @8 q0 f( Y' J【结果】阳性结果是胞浆内出现蓝色沉淀。2 d3 K. Z6 N7 h& J2 L( H
3 d+ v0 E! R' {" `' B
6 t Y! l4 L! h' i$ x$ T9 l7 o# y* |: w$ c. [% H* `
6 f6 x0 @7 t1 u) C, {$ m
* F+ h" ~- m# @+ J- r8 G针对钙沉积物“钙结节”的染色方法：
8 C0 x/ t, w, i6 n, R' z& q4 q4 g7 b. p- R
% u) s3 q1 S3 X: t& Z$ p4 茜素红法
& g! n( f( c& l' I" Q) ~. V1 S
; R& q' `: g; b- E( T% L【作用原理】利用沉积的钙于茜素红发生显色反应，得到红色的染色效果。
/ q7 f- o9 ^. \* W' N- _0 O" [2 P$ J【步骤】1 K: K: h0 [. C- o# G" d9 c {
（1）培养皿用PBS冲洗2次，95%乙醇固定10min，双蒸水冲洗3次。
5 Q" ~# D0 i; V（2）0.1%茜素红-Tris-Hcl（PH 8.3）37℃，30min。3 B1 m+ I" w# x) ?& F
（3）蒸馏水冲洗，干燥，封片。
e, @$ B; R! F. `' K【结果】染料品种的不同，矿化结节呈现不同的红色。4 |5 F; |' X+ a& N
2 J' T) z% ~ o. g# E# m
9 G q. V; b g4 I
5 von Kossa法
' ?1 |" D4 ~0 z8 v" u: ` w% H【作用原理】
1 z$ `1 p" K; Z' A) s( N7 L: u" @0 t5 V1 v7 I- w! j
Von Kossa’s矿化结节染色法原理是将矿化基质中的磷酸盐(钙)、碳酸盐(钙)转变为磷酸银、碳酸银，然后用日光、紫外线或强还原剂使其还原为黑色的金属银。本试验染色过程中未作细胞衬染。+ f0 [) O" H( ^
# o- R5 ?5 Y, G% o4 h- x# Q( d【步骤】
# A6 u& T* ^3 V' w; c6 F ^（1）培养皿用PBS冲洗2次，4％多聚甲醛固定5分钟，双蒸水冲洗3次。
# B, k+ y7 s4 u$ R* @6 P（2）培养皿中加入5％硝酸银溶液1ml，将培养板开盖在紫外灯下照射1小时。 W/ L' b! A0 k0 u. S! c) @7 `
（3）倒出残留的硝酸银溶液，蒸馏水冲洗3遍。& E4 S. A6 V0 A+ w
（4）培养皿中加入5％硫代硫酸钠溶液1ml，中和残留的硝酸银溶液，吸出残液。( J, g- o1 v8 ^* G( L
（5）室温下晾干，封固。 |
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发表于 2009-5-4 15:19
发表于 2009-6-13 20:46
