你好，我培养人脂肪间充质干细胞但是细胞生长太缓慢

wuht68

你好，我培养人脂肪间充质干细胞，胰酶消化后1：3分盘，细胞稀、培养过程中有变大变薄现象，经过20多天的培养，细胞终于长到70%的汇合度，显微镜下细胞形态还不错（长长的成纤维状），但是细胞生长太缓慢了，不知生长缓慢是否和我胰酶消化传代时有关，我把我的消化条件写下来，能否请您帮我看一下：; @- U& l4 {' z( v) b% O' v: w0 O
细胞为第三代人脂肪间充质干细胞
. {) z- j$ E; t& e9 ^胰酶：0.25%+EDTA
0 d' k8 K% ?: \% r胰酶加到培养皿中，至贴壁细胞全部漂起，加培养液终止消化
6 Z! p+ @7 c1 L1:3分盘（我接下来要调整为1：2）
3 k3 O3 f7 J/ z& W能否提点意见，谢谢！
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watchen198891

回复 wuht68 的帖子
0 C* @9 _6 f; e( K5 T
' X/ s9 y# @8 F# R细胞消化时间可以适当放短，细胞变圆后就可以轻微吹打下来，不需要把细胞消化到直接漂起来，有些过了。7 S$ C0 V0 k2 J# p

veda327

我的意见是：能不用EDTA，尽量不用，宁可胰酶时间长一点消化！& p/ l; ~1 ^6 k0 p6 U- z  g9 |
从你的描述来看：消化了直至贴壁细胞全部飘起，明显的消化过了！

随时准备下线

: \9 b1 j5 H- H" F" ?9 A

: |7 g. O( {9 y4 a6 Y8 S2 s) V我自己的看法：
+ G1 ~  b  @! \1、时间和温度：大家都是细胞尽量变圆就可以终止消化，我实际操作过程中发现，加了胰酶二十秒左右可能细胞就开始飘起来了，如果加的量不够多的话，很可能现加的地方都飘了，有的地方还没消化好，不好控制。所以，有时候可以不用放在37℃环境中消化，胰酶37℃预热就可以了。/ l1 v. S; |+ H9 w1 ]
2、EDTA：我也建议不要加，我觉得它对细胞损伤有点大% \$ v8 |# I4 o9 V8 m2 S3 j
3、胰酶量：可将0.25%胰酶稀释一倍后使用，我自己觉得稀释后相对更好控制。
6 `8 ?' b7 U3 r1 t4、传代：我觉得这个和你的细胞状态及传代时的密度有很大关系，我都是1:3传，三天一代没问题。传代太频繁也不好。

晗晗

我觉得不用加EDTA,把胰酶稀释了就行啦,然后消化的时间也不用那么长,还有就是中间可以换换液,这样细胞能长得快些

wuht68

谢谢大家！8 B. I+ G' [! _: H3 X6 B
我已配好不含EDTA的胰酶，希望有好结果。

刘小明

20天时间太长了，最大的原因很有可能是细胞已经老化，基本4-6天一代。

蜗牛爱贝贝

1、消化方法：细胞一般不建议消化漂浮起来 这样对细胞损伤太大了，细胞开始变形 20-50%脱漏就可以终止消化了，还有没有必要放到37度环境下 室温就可以以 ，如果消化时间太短，控住不好消化时间可以用盐水适当稀释胰酶 （1:3或者1:2、2:3） 。1 c4 b- i+ E2 R6 E1 o1 \" D
2、EDTA：建议不要加，我觉得它对细胞损伤有点大" Q# o( H/ N" b5 d
3、传代：传代前尽量计数下  不要凭感觉传代或者凭经验  计下数  比较科学    1X106-1.5X106   我个人比较喜欢的（T175瓶子）

Dunncao

弱弱地发表下自己的意见。2 {0 S. P+ r% \6 z! c5 i
你说传代后发现变大变薄，那么消化中肯定存在问题，关于浓度和是否加EDTA，大家已经给出很多建议。我想强调的是消化的时间，镜下观察细胞收缩变圆就拍一拍，立即终止。或者迎光看有细胞细沙状或是片状往下掉就可以终止了。
7 F4 B4 ]* T) S另外，细胞长得慢并不一定完全是消化损伤的问题，如果没传代前就有这样的情况，那我觉得更应该从培养体系入手找原因了。