你好，我培养人脂肪间充质干细胞但是细胞生长太缓慢

wuht68

你好，我培养人脂肪间充质干细胞，胰酶消化后1：3分盘，细胞稀、培养过程中有变大变薄现象，经过20多天的培养，细胞终于长到70%的汇合度，显微镜下细胞形态还不错（长长的成纤维状），但是细胞生长太缓慢了，不知生长缓慢是否和我胰酶消化传代时有关，我把我的消化条件写下来，能否请您帮我看一下：, A. Q* q2 d6 f: V( `" u, p
细胞为第三代人脂肪间充质干细胞
$ W$ ~+ E' B& r+ J) F胰酶：0.25%+EDTA
3 E& `* Y' m3 f; i6 m5 ?' W+ _. P胰酶加到培养皿中，至贴壁细胞全部漂起，加培养液终止消化
5 n& t6 T# i/ G0 T, k2 Q" R1:3分盘（我接下来要调整为1：2）
7 E2 O7 r7 K% Z) V/ ?+ c能否提点意见，谢谢！' v0 w- d- ?0 ?" ^+ v
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watchen198891

回复 wuht68 的帖子+ W' \5 i" n6 B, D! `
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细胞消化时间可以适当放短，细胞变圆后就可以轻微吹打下来，不需要把细胞消化到直接漂起来，有些过了。6 p2 m0 E" ~. z3 `

veda327

我的意见是：能不用EDTA，尽量不用，宁可胰酶时间长一点消化！7 [1 p0 V0 p# F: E5 F; T
从你的描述来看：消化了直至贴壁细胞全部飘起，明显的消化过了！

随时准备下线

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6 y& O& l8 }8 K* j" v+ C9 f3 E' {我自己的看法：6 o7 r8 o6 V7 w9 i" [
1、时间和温度：大家都是细胞尽量变圆就可以终止消化，我实际操作过程中发现，加了胰酶二十秒左右可能细胞就开始飘起来了，如果加的量不够多的话，很可能现加的地方都飘了，有的地方还没消化好，不好控制。所以，有时候可以不用放在37℃环境中消化，胰酶37℃预热就可以了。
. w6 p/ o4 f' I4 D6 A2、EDTA：我也建议不要加，我觉得它对细胞损伤有点大7 E, U) e8 {# I# q$ M0 ^9 r
3、胰酶量：可将0.25%胰酶稀释一倍后使用，我自己觉得稀释后相对更好控制。
7 t% P  P, v' k: f8 v+ @* u4、传代：我觉得这个和你的细胞状态及传代时的密度有很大关系，我都是1:3传，三天一代没问题。传代太频繁也不好。

晗晗

我觉得不用加EDTA,把胰酶稀释了就行啦,然后消化的时间也不用那么长,还有就是中间可以换换液,这样细胞能长得快些

wuht68

谢谢大家！3 o$ B# R: v% B6 W/ ?& g6 j
我已配好不含EDTA的胰酶，希望有好结果。

刘小明

20天时间太长了，最大的原因很有可能是细胞已经老化，基本4-6天一代。

蜗牛爱贝贝

1、消化方法：细胞一般不建议消化漂浮起来 这样对细胞损伤太大了，细胞开始变形 20-50%脱漏就可以终止消化了，还有没有必要放到37度环境下 室温就可以以 ，如果消化时间太短，控住不好消化时间可以用盐水适当稀释胰酶 （1:3或者1:2、2:3） 。
8 ~; ?2 F. |0 T% {0 F+ q" k2、EDTA：建议不要加，我觉得它对细胞损伤有点大
" Z8 j4 |% i0 R3、传代：传代前尽量计数下  不要凭感觉传代或者凭经验  计下数  比较科学    1X106-1.5X106   我个人比较喜欢的（T175瓶子）

Dunncao

弱弱地发表下自己的意见。
8 @  I  j4 Q( Q+ u& D2 X0 h你说传代后发现变大变薄，那么消化中肯定存在问题，关于浓度和是否加EDTA，大家已经给出很多建议。我想强调的是消化的时间，镜下观察细胞收缩变圆就拍一拍，立即终止。或者迎光看有细胞细沙状或是片状往下掉就可以终止了。4 G* _& v# O  @
另外，细胞长得慢并不一定完全是消化损伤的问题，如果没传代前就有这样的情况，那我觉得更应该从培养体系入手找原因了。