你好，我培养人脂肪间充质干细胞但是细胞生长太缓慢

wuht68

你好，我培养人脂肪间充质干细胞，胰酶消化后1：3分盘，细胞稀、培养过程中有变大变薄现象，经过20多天的培养，细胞终于长到70%的汇合度，显微镜下细胞形态还不错（长长的成纤维状），但是细胞生长太缓慢了，不知生长缓慢是否和我胰酶消化传代时有关，我把我的消化条件写下来，能否请您帮我看一下：
% F, q4 W: V9 ^( y7 @4 o% u细胞为第三代人脂肪间充质干细胞
3 ]1 d4 I" {9 z' j1 e0 ?, ~胰酶：0.25%+EDTA* C5 T4 h, t/ {3 t8 Q5 T& o1 V
胰酶加到培养皿中，至贴壁细胞全部漂起，加培养液终止消化$ X. p/ B' z, u1 p. F
1:3分盘（我接下来要调整为1：2）
) ~7 A# I' B% b1 [! p5 x( L能否提点意见，谢谢！/ w8 V  Q, ~1 f& W) g1 W

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watchen198891

回复 wuht68 的帖子
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1 Y  o( W% U7 i  W细胞消化时间可以适当放短，细胞变圆后就可以轻微吹打下来，不需要把细胞消化到直接漂起来，有些过了。
5 M, @8 g/ w; U/ b% \

veda327

我的意见是：能不用EDTA，尽量不用，宁可胰酶时间长一点消化！1 y, r' A& k7 p. p
从你的描述来看：消化了直至贴壁细胞全部飘起，明显的消化过了！

随时准备下线

& |& M6 g6 V$ `2 Y

* W* U. C" f" ]! ~: P/ a6 L" z) b我自己的看法：) G3 E! s2 b3 \9 V
1、时间和温度：大家都是细胞尽量变圆就可以终止消化，我实际操作过程中发现，加了胰酶二十秒左右可能细胞就开始飘起来了，如果加的量不够多的话，很可能现加的地方都飘了，有的地方还没消化好，不好控制。所以，有时候可以不用放在37℃环境中消化，胰酶37℃预热就可以了。' n5 n% }) O$ d: \6 q
2、EDTA：我也建议不要加，我觉得它对细胞损伤有点大7 q3 K4 Z1 M/ ~" [
3、胰酶量：可将0.25%胰酶稀释一倍后使用，我自己觉得稀释后相对更好控制。. j3 ^% ]) Q1 b
4、传代：我觉得这个和你的细胞状态及传代时的密度有很大关系，我都是1:3传，三天一代没问题。传代太频繁也不好。

晗晗

我觉得不用加EDTA,把胰酶稀释了就行啦,然后消化的时间也不用那么长,还有就是中间可以换换液,这样细胞能长得快些

wuht68

谢谢大家！
1 g3 a" W5 j6 s* D4 H. }- ~我已配好不含EDTA的胰酶，希望有好结果。

刘小明

20天时间太长了，最大的原因很有可能是细胞已经老化，基本4-6天一代。

蜗牛爱贝贝

1、消化方法：细胞一般不建议消化漂浮起来 这样对细胞损伤太大了，细胞开始变形 20-50%脱漏就可以终止消化了，还有没有必要放到37度环境下 室温就可以以 ，如果消化时间太短，控住不好消化时间可以用盐水适当稀释胰酶 （1:3或者1:2、2:3） 。- J) _( Z% h) S' P5 r6 X2 a
2、EDTA：建议不要加，我觉得它对细胞损伤有点大
1 _4 [! ?4 ~8 f  A: B6 N7 E, V4 o1 p3、传代：传代前尽量计数下  不要凭感觉传代或者凭经验  计下数  比较科学    1X106-1.5X106   我个人比较喜欢的（T175瓶子）

Dunncao

弱弱地发表下自己的意见。2 L& I  u- D' w6 y: G
你说传代后发现变大变薄，那么消化中肯定存在问题，关于浓度和是否加EDTA，大家已经给出很多建议。我想强调的是消化的时间，镜下观察细胞收缩变圆就拍一拍，立即终止。或者迎光看有细胞细沙状或是片状往下掉就可以终止了。
5 L" f0 S% T+ T; c" X另外，细胞长得慢并不一定完全是消化损伤的问题，如果没传代前就有这样的情况，那我觉得更应该从培养体系入手找原因了。