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天然噬菌体抗体库构建和筛选的实验方法` 2 |! b, T) f$ k: V, k3 M
% F. a4 q: m2 P; B
一 原理 o$ O. G' P5 ]- b/ q$ r
噬菌体展示技术是将外源DNA通过基因工程技术克隆到适当的噬菌体载体4 a) r# o' B. ~. n
上，使外源DNA片段对应的表达产物融合在噬菌体的衣壳蛋白上形成融合蛋白) h: x. Y% f& @' g2 K
呈现在噬菌体表面，被展示的多肽或蛋白可保持相对的空间结构和生物活性。然* v) B+ c9 E, ]+ r3 y, b8 | a
后利用靶分子，采用适当的淘洗方法洗去非特异结合的噬菌体，最终从噬菌体文( t( z/ w) ~; K8 ^# a
库中筛选出能结合靶分子的目的噬菌体；外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面6 h% j" K3 c( v* B: c$ f; T0 Y6 l
而其编码基因作为噬菌体基因组中的一部分可通过噬菌体DNA序列测序出来。该
8 x |/ W# @. o X0 Q技术的显著特点是建立了基因型和表现型之间的对应关系。
# G5 m% `! U9 C
8 r, o0 z- z. e! D( |3 v& q图不能复制
3 F% l6 O K- n* Z5 x, I# \: V3 H4 [/ M- h1 p. P, S |
% F' M R7 |+ p3 l/ Y$ g
二 简要操作流程 . }3 @* f: [# e$ \, F3 ~
1. 从标本中提取总RNA。 : ~) I1 w3 }) e$ s- m* [* u3 ?
2. 合成cDNA。 & h# u) q$ E7 s6 T- ^/ n w. y. {
3. 用PCR方法扩增轻重链可变区基因。 $ i( B) Q- P( ]$ B& P+ A3 i
4. 采用SOE-PCR(重叠延伸拼接法)将轻重链可变区基因装配为scFv。
' I1 y+ g4 J" `: d. I- L6 C* Z5 c, e5. Sfi消化扩增的scFv片段。 % H( k3 j/ G- [# {! M
6. Sfi消化质粒载体PAK100与scFv片段连接。
! D' ?' K* O8 [/ T: `7 X8 Z7. 电转化XL1-Blue大肠杆菌。 . h8 @' F9 V- R0 N$ B( L% a
8. 扩增XL1-Blue大肠杆菌建立噬菌体库。
$ P8 X7 z8 G2 R( Y9. 筛选富集目的scFv。 ) Y: K8 @" V& g
10.做亲和力鉴定。3 e% R' z1 y, B) q; B
4 a5 F% u- Q( Y' S
二 实验材料 / X: Q; i% v$ j$ j9 h3 }- \
1. 材料
$ N2 Z; C( j- x7 l; k! w; i" n1.1 菌株、载体和细胞 , U& f; r$ E/ j
1) 质粒PAK100、 E. coli XL1-Blue、辅助噬菌体VSCM13为本实验室保存。) m- O0 _+ Y& V$ c5 ?- Z g' R X
1×106 -5×106对数生长期或冻存的杂交瘤细胞或脾细胞自行制备。 9 A' _/ k$ N4 g/ X* r5 t
2) 设计与合成引物 根据文献《重组抗体21-23设计和合成引物。 6 i4 V6 X8 _7 y3 p* n
1.2. 试剂与仪器
7 W9 j1 ]0 N. G/ F) WTRIZOL( Invitrogen 公司)，AMV-Reverse Transcriptase ( Promega 公司)，WizardPlus 8 ^ d$ c3 U. v, A* [) n
SV Minipreps DNA Purification System ( Promega 公司)，限制性内切酶 Sfi I，T4 连0 `2 H& H- K5 C4 r' @' H' Q
接酶( TaKaRa公司)，HRP标记抗M13抗体( Promega 公司)、电穿孔仪，Bio-Rad公% d: v7 @- h0 ^3 R/ J+ t
司，PCR仪（senscquest公司）。
. ]! ^4 _# P( w% g6 t1.3缓冲液和培养基的配置 0 {& F1 J- K8 s
1.3.1缓冲液 " r/ y! N% Q. a% ^5 \1 j
1) 10×PBS(0.1M)：称取80 g NaCI，2 g KCI，20.6 g Na2HP04 12H20，2.4 g KH2P043 O8 c+ W# p" ]" v. f) z
加去离子水至900ml，调节pH值至7.4，定容至1 L，高压灭菌。
/ ?. G1 J. ?, P9 VPBST：在1×PBS中加入终浓度为0.05%的Tween 20。 ' }/ y7 ]' t/ G. q/ |4 k
3%BSA/PBS：在PBS中加入终浓度为3%的BSA，调PH值7.4，过滤除菌（即# b0 c# l) }. R4 b5 Y9 p
用即配不能长期保存）。
2 Z# _) F: b: H) C: B
8 S4 T' G& w5 X' X2) 20xTBS溶液150ml：称取18.2g Tris-HCl、26.1g NaCl，溶于100ml去离子水，0 Y1 Y& e, u" k' p: E; V8 ]
定容至150ml。用时1:20稀释，加0.05%的Tween 20即为TBST，可用于
- c6 n6 ^' D5 W( |" g7 S) k洗涤。
1 c! _) N M( \2 R3) 5×PEG/NaCl(20%PEG，2.5 M NaCl)：称取200 g PEG 8000和150 g NaCI，用4 i1 J- {9 r* U9 v/ u
去离子水定容至1 L，加热溶解，高压灭菌。 6 ]( ?9 H- X; O) c8 X
4) 0.2 M GIy/HCI洗脱缓冲液：加入1.5 g甘氨酸至90 ml去离子水中，用浓盐
2 G. l! t" l7 [( `3 v) H酸调节pH至2.2，再加入100mgBSA，用去离子水定容至100ml，过滤除菌
8 a6 r6 P* q! V, T+ I7 ]4℃保存。
. p; i1 }1 Q1 j. F0 X1 k* F5) 2MTris：242 g/LTris每次配20ml即可。
: \$ r5 u% ` f4 J1.3.2培养基
9 z7 W4 K. ]6 {2 b# c# u1) LB液体培养基：Tryptone 10g，Yeast extract 5g，NaCI 10g，用双蒸水定容至
7 a& N' b; `3 S5 f y4 U( C1000ml，高压灭菌后，4℃保存, 0 N. P3 Z: y W; \: g. W- v/ {4 }
LB固体培养基：在LB液体培养基中加入琼脂粉至终浓度为1.5%高压灭
! p9 p2 N6 X! T7 j菌后4℃保存。 $ P. X+ d" G" n& m M/ _" ?2 |
2) 顶层琼脂：每升含：10g Tryptone，5g yeast extract，5 g NaCI，1g MgCl2·6H20，
8 w& k& l" C, q7 g琼脂粉。高7g琼脂粉。高压灭菌，4℃保存，用时微波炉融化。
' y. d/ X1 i0 s; U3) SOB培养基：20 g/L胰蛋白胨，5 g/L酵母提取物，0.5 g/L NaCI，10ml的 250mmol/L的KCl或（186mg的KCl），用去离子水定容至1 L，高压灭菌，冷却后加入10ml 的1mol/L 的 MgCl2 于室温下存放。
7 m$ F/ j8 j% Q/ p. ?% }4 z+ t' R' `SOC培养基：每100ml SOB培养基加入2ml 1mol/L的葡萄糖（过滤除菌）。 0 {$ G2 ^2 Z* [0 A7 q
20%葡萄糖：称取20g无水葡萄糖，用双蒸水溶解后定容至100ml，用0.22 u m ,滤膜过滤除菌，-20℃保存。 % j, r6 p/ J: c
1mol/l MgCl2：称取203g MgCl2.6H2O溶于1 L去离子水，高压灭菌（一般配100ml
) b- v& G& S3 M; z5 ?% Y+ @即可）。 4 t1 _& U1 Z- s
4) 2×YT培养基：16 g/L胰蛋白胨，10g/L酵母提取物，5 g/L NaCI，用去离子水定容至1 L，高压灭菌。
- A5 ~8 ^8 N$ I7 A! \: L8 R5 O# \2×YT培养扳：含15%/L琼脂粉的2xYT。
. r1 O. a: Z5 h2×YT-氯霉素葡萄糖培养基板：含30微克/ml氯霉素（1ml培养基加入1.2微升25mg/ml的氯霉素溶液）及2%的葡萄糖2xYT培养板，待冷却至低于50℃时，加入氯霉素贮液，混匀倒平板，平板4℃避光贮存。
$ o6 L( _/ s# P2 M( j
* A9 h! L, D. X* c1 j7 g三、方法
, r8 c+ ^5 M/ ^ RNotes：接触了噬菌体的器材要160℃消毒3到4小时，噬菌体液体不能污染，否则实验就不能进行下去！ 0 G) U! @' \! ?: o1 m' y
1. 噬菌体及宿主菌的制备
! X& k0 |8 M5 r# p) P G1.1辅助噬菌体敏感宿主菌的制备 : h/ u) Y7 c) l" W M3 P3 D1 D( o
1) 方法
) P. J0 B g" {! ~2 u. v; z从-70℃保存的大肠杆菌XL1-blue储存管挑取细菌分区划线接种于含四环素的LB平板，37℃培养过夜。分别挑取单个菌落接种多管2ml SB(含四环素10μg/ml-1)，37℃ 250 r/min，振荡培养至对数生长期(OD600=1，通常5h)。取VCSM13保存液稀释至10-8加分别加2μl到上述大肠杆菌XL1-blue菌液100μl，37℃缓慢震荡20min（80 r/min），加入高层琼脂浇板37℃孵育12~16 h，观察噬菌斑鉴定该菌对VCSM13的敏感性。
9 B y5 W x9 ?- s2) 实验准备 4 l+ ^4 Y; N0 _& w# o: J
i. 准备和菌落数相同的LB板，放到37℃预热 " I; D g9 j6 G# _
ii. 准备0.7%的高层琼脂预先微波炉加热熔化后放入45℃水浴锅中 . K; r* a! K1 N
iii. 2ml消毒好的SOB培养管数个
5 p* E( V3 C% x7 J0 ^iv. 装45℃水的大烧杯一个，倒上层琼脂时将装0.7%高层琼脂的烧瓶放入 5 J! R7 |5 r; p! l* W1 E' q
1.2 辅助噬菌体的扩增
' p N* b$ {: E1) 方法
( O' z) H: Y* W. s辅助噬菌体通常保存于4℃，大量制备时应挑取遗传背景相同的单个空斑扩增，以减少变异株。将1012PFU/ml的VCSM13系列稀释至10-8。取经鉴定对VCSM13敏感的新鲜大肠杆菌XL1-blue（OD600=1）分装成每支100μl，加入稀释的VCSM13 2μl，37℃缓慢震荡20min（80 r/min），分别加入3ml 45℃高层琼脂混匀，立即倒入预热无抗生素LB琼脂板，37℃培养过夜。
6 {" W# w- e3 z! M% l, s2 B吸取经鉴定对VCSM13敏感的XL1-blue 菌，按1:500接种于5mlSOB培养基中，(含四环素10μg·ml-1)，37℃ 220r·min-1振荡培养1 h，挑取辅助噬菌体单个空斑接种入该培养物，继续37℃振荡培养2 h，转入100 ml SB(含四环素10μg·ml-1，卡那霉素70μg·ml9 {8 j8 P$ }# t' \$ Q4 s
-1，加20%葡萄糖2ml，1mol/l MgCl2，1ml) 37℃220 r·min-1振荡培养过夜。 1 k1 S3 @# h& p0 i
2) 实验准备：同上
+ r+ o) o3 p \0 T4 h1.3 辅助噬菌体滴度的测定 , G6 D. ^9 n! o4 l+ v9 z. R
将上述扩增辅助噬菌体无菌分装50 ml离心管，室温4 000 r· min-1离心15 min，收集上清液，再分装50ml离心管， 4℃保存。用LB稀释VCSM13至10-8，分装OD600为1的大肠杆菌XL1-blue每支100μl，加入稀释的VCSM13, 2μl，37℃缓慢震荡20min（80 r/min），加入3ml 45℃高层琼脂混匀，立即倒入预热无抗生素，LB琼脂板37℃培养过夜计数空斑。 " q! y) k# A) |0 T- D
噬菌体通过噬斑形成单位(plague forming units,pfu)确定滴度。计数方法:
4 X$ G& n% m& A" @, M+ t( P) {6 N 5 \! ]8 U9 X- r: _/ `. V
经扩增的VCSM13滴度为1×1011~2×1011PFU/ml。
2 W8 u5 v+ B* I; W( i c+ y. Y, P3 t$ p2. 大肠杆菌电转化感受态细胞制备
6 ?1 q& z% e% Z! P, B" |) y2.1第一天： $ E/ L6 a; M3 A/ `1 v% I
1) 将适合菌株（如XL1-Blue, DH5α）划板，在37°C下过夜培养 . P1 A& U4 ^ r% `0 w' f2 C
2) 高温灭菌大的离心瓶（1000ml）两个，每瓶装200ml的2×YT培养基以备
L6 y% e. }( T9 I9 b( p第二天摇瓶用
( w H3 F$ N* y1 I1 _' p3) 1L 10%灭菌甘油或蒸馏水保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细胞用。 / d3 f) b, U, v U4 ?3 B
2.2第二天
# \) Y8 ? L' z3 f/ s! i1) 挑单克隆于5ml的2×YT培养基中在37°C下过夜培养 8 \1 g. z4 v! j5 F7 D1 v" w
2.3第三天：- ~. n9 G: k$ i+ k5 O4 d; q
1) 取上述过夜培养物按1:100至装有200ml 2×YT的1升三角瓶中，接种两瓶。
1 _5 h. q! Z0 G' l, [4 d( Z2) 37°C下剧烈振荡（220转）培养2-3小时
* ]* Q) R9 k1 y6 V. W5 n" Y/ _3) 定时监控OD600值（培养1小时后每半小时测定一次） ( _% z! b% e+ T, M2 z* z
4) 当OD600值达到0.5左右时，从摇床中取出摇瓶，置于冰上冷却至少15分6 O- W& N$ B' H- h8 | b
钟（需要的话这种方式可以存放培养液数小时） % U* R; T/ u: A
5) 细胞在4°C 2500g（4000转）下离心5分钟，弃上清液（如需要，沉淀可在% n- b% V- v# G8 y/ l9 D
4°C的10%甘油中保存一两天）
: c9 z2 l* h4 h. g6) 用少量的（约3-5ml）灭菌的冰冷10%甘油重悬浮细胞。然后冰冷10%甘油) w; e; v8 G8 O' k0 B* y5 K
稀释至离心管的2/3体积。
$ P$ f) o( i+ S7 p7) 照上面步骤重复离心，小心弃去上清液 " n+ n1 h8 B. E; L% S' D7 m
8) 照上面步骤用灭菌的冰冷10%甘油重悬浮细胞 " L! y! i$ N, x4 w
9) 离心，弃上清液（可以再洗一遍） 1 r# D6 a( R% L2 U' `" z
10) 用20ml灭菌的、冰冷后的10%甘油重悬浮细胞
0 {- ]5 ]$ H$ U11) 照上面步骤离心，小心弃去上清液（沉淀可能会很松散）
) z# T2 i1 u2 n$ ^' e) }4 o12) 用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2-3ml，保证细胞的最终浓度为:稀释100倍后OD600=1
- t6 A& Q6 X7 y/ l* M6 ?3 z( o# ^13) 将细胞按50μl-200μl等份装入微量离心管，于-80°C保存 5 L8 e5 U9 z7 j+ h/ S% v5 Q
Note：甘油会降低转化效率，如果不冻存，可以用蒸馏水洗，做的过程中要注意低温。 + W$ q% i- P- x" E0 J
3. 转化方法:
; _/ }; W" g0 ^3.1. 在冰上解冻电感受态细胞添加1-3μl DNA，质粒1ul，连接产物2-3ul，冰上培育约5分钟。
% B: ?9 }$ r7 D2 \& p4 F0 G" `' [3.2 转移DNA/细胞混合物至冷却后的1mm电穿孔容器（无泡）中 / [) k5 _: Y" y6 P9 l( n$ s
3.3设置电穿条件，准备好300μl LB 或 2xYT
F. H u$ C' w1 g6 ?8 ^3.4 对电穿孔容器进行脉冲 9 i' t0 g2 b( N% `6 l+ y
3.5 立即添加300μl 的LB或2xYT至电穿孔容器中 5 r; ?6 V' A; Y% ~& b
3.6 37°C下培养细胞30分钟至45min以复原（如果做质粒转化此步骤可以省略） % S9 M1 g% c( M! q
3.7转移细胞至适当的固体选择培养基上培养 " o) d2 @4 M( ?! r2 c; n
4 . PCR扩增抗体V区基因 3 o3 M4 {/ s7 T* ^2 w- m) d& z, \
4.1 混合引物的配制 # g9 X# V6 t! b: _
引物按说明书稀释，稀释引物之前先最大速离心5min，轻轻打开管盖，每
! Y) M" G3 J `+ f3 y) S管引物加入超纯水的量是OD×10，配成100μmol/ml，充分震荡5min，用时按下; [+ \ b& F% j6 Q5 I
表加入各种引物，混合在一起，根据实验需要进一步稀释。 # K, ^0 W3 d: D- c. }1 _, c
LB1 LB2 LB3 LB4 LB5 LB6 LB7 LB8 LB9 LB10 5 u2 J u& I0 c9 f
2 2 3 3 3 4 4 2 2 3
0 `+ m4 o2 [! X m
1 {3 }6 w1 }+ _3 X/ C, R- _7 E; bLB11 LB12 LB13 LB14 LB15 LB16 LB17 LBλ
3 ^4 o0 ]/ \1 g2 ~+ L4 4 4 2 2 2 2 2
6 O! Y+ X4 R% x% z _8 ~# r \
F' f1 ]0 s/ {' p6 I5 NLF1 LF4 LF5 LFλ$ D* m5 a G/ {! p
19 9.5 9.5 2. X+ v4 k+ ^' y( {3 J1 ] a8 ?
: M7 F! h! ~6 N P
HB1 HB2 HB3 HB4 HB5 HB6 LB7 LB8 LB9 LB10
2 u) h. @9 W6 ]" _! d9 u3 3 2 2 4 3 2 3 4 2: t; H$ d& n& N( ^" L
0 Y6 x; q) k3 W' A- B" ]- Z+ b
HB11 HB12 HB13 HB14 HB15 HB16 HB17 HB18 HB19
" [% ~8 d2 `' V0 Y& ~4 T `- ]3 \6 e3 2 2 3 3 3 3 2 24 W8 p" Z6 d! @0 Z# U8 J& k. ?8 N* O
9 z4 C h1 t8 P$ C# h
HF1 HF2 HF3 HF4) \( f% Q, s) @3 j- v7 }8 c
10 10 10 104 c# g x! w: J
Scfor和scback先配成100μmol/ml根据实验需要进一步稀释。
: X' O: v$ Z* i" q4 n6 @# }( Y
- @# |/ t" R8 K8 g: `/ k4.1 VH基因扩增 - @1 @, @/ t; Z0 }" j
1) 25µl反应体系
: {1 S' m- E# m& R' a1µl cDNA、2.5µl的10x缓冲液、2.5µl的MgCl2(25mM)、2.5µl的dNTP混合物、1µl 的HB 和1µl的HF，TaqDNA聚合酶0.25µl，补水至25µl。混匀，短暂离心。 " _* l* D2 I6 E) H, u( t
2) PCR反应条件为 9 S4 a* l! z0 f* P% [* v3 L. a$ M
94℃、3min，（ 94℃、30s， 54℃， 57.2℃，60.9℃ 40s， 72℃ 40s），30个循环，72℃ 10min。 7 F) d3 j) t0 H/ E3 q
4.2 VL基因扩增 3 B& p5 h0 y g+ [, [/ ~/ Y$ |9 |
1) 25µl反应体系
; [" P w* n9 |6 A* n1µl cDNA、2.5µl的10x缓冲液、2.5µl的MgCl2(25mM)、2.5µl的dNTP混合物、1µl 的LB 和1µl的LF，TaqDNA聚合酶0.25µl补水至25µl。混匀，短暂离心。
5 a4 g: ?. k( O1 z) J2 R' D( G h2) PCR反应条件为：同重链 " Z4 K3 H& E( X% g/ [# h
4.3 VH和VL PCR产物纯化及浓度测定 q6 q4 \" I% T/ M
用胶回收试剂盒回收VH和VL PCR产物，通过电泳确定回收量。
9 J+ ^6 n8 i+ D8 O) \2 s0 r4.4 scFv的扩增 9 A. d; v! a* p; F+ T: g" O3 Z
1) 25µl反应体系： - ~( }/ ]% `- V& i
VH和VL PCR产物 (60ng)、2.5µl的10x缓冲液、2.5µl的MgCl2(25mM)、2.5µl的dNTP混合物、1µl 的scFOR和1µl的scBACK，TaqDNA聚合酶0.25µl，补水至25µl。混匀短暂离心。2 R- t! ~/ ~2 z% F* u
! G0 G, S5 `( A }8 J1 j4 e) r; x2) 反应条件 0 p: @5 ?3 E" i+ U5 J7 l4 q
92℃ 3min，（ 92℃ 1min，63℃ 30s，58℃ 1min，72℃ 1min7个循环）（92℃ 1min，63℃ 30s，58℃ 1min72℃ 1min），25个循环。 & \; M: z( w( K# O5 v( B: [1 [
4.5． scFv的酶切消化 2 X% h3 Y" g1 {) T t
1)加入下列试剂于无菌微量离心管中：50µl scFv纯化DNA片段、10µl的10xM缓冲液、2µl TaqDNA聚合酶(20Uper reaction)、35µl灭菌双蒸水，总体积100 ul。 ( x2 y6 u' v) C; v- X( e
2)混匀，50℃、2h。加入40µl无水乙醇， 4℃ 1 h。12 000 r/min，10 min，室温挥发乙醇。 _; j4 S% f0 F
经质量测定可用于与相应载体相连接。 / m- Q" S& }! F% }, v8 v
5 噬菌体抗体库的构建
$ ]) B8 }- O0 w5.1 转化
/ z) m% l1 O9 ~* ]4 p3 kScFv片段和载体PAK100经sfiⅠ酶切后，用T4连接酶连接，电转化入X-Blue感受态菌，加培养基（2×YT+2%G）1ml，37℃培养1h后，取实验组转化菌1µl平铺2×YT-氯霉素葡萄糖培养基板，30℃过夜。第二天对稀释菌涂布扳上长出的菌落进行计数，计数实验组转化菌形成的菌落，估算库容，库容量(cfu)=菌落数×稀释倍数，4℃保存平板。
, u) z3 e6 N. L/ N, X! b5.2辅助噬菌体挽救文库
; q6 r7 q5 e* u7 y2 k6 G1) 取实验组转化菌1ml，加入20ml 2xYT氯霉素葡萄糖培养基中，30℃、200 r/min培养2h或更长时间,至OD600=0.5左右,使细胞处于对数生长期,得以表达F性鞭毛。 8 S1 e4 U. f! g& b2 W2 Z- d: I
2) 加入4×1010pfu的M13K07辅助噬菌体(噬菌体：细菌=20:1)，37℃，静置10 min，250 r/min培养1 h。
) J4 Y' G2 W0 Q; S. V3) 4 000 r/min离心10min,重悬沉淀于200 ml 2xYT氯霉素葡萄糖培养基中,30℃过夜振荡培养。 " x3 t, G7 K% P: `7 {7 w
4) 4 000 r/min离心5 min，收集上清，加入1/5体积量PEG/NaCI,混匀，4℃静置45min。
6 w; O. c! J0 F" J/ a3 L5) 4℃、10000 r/min离心20min，弃上清，用2m1或4ml PBS重悬沉淀，建立初级scFv噬菌体抗体库。
6 ]# J; ?5 }+ z# j" n6 噬菌体抗体库滴度的测定
8 t# ^# r9 x) K% M \* T! Y; f) c" f取不同稀释度的体抗体库溶液2µg加到 100µg XL1-Blue（OD600=1）菌液中，菌液37℃放置20min，铺板，过夜培养，计算集落形成单位（cfu）。
; [/ s0 _' t% Z2 K: y2 M7 目的噬菌体抗体库的筛选 # ]9 H6 d7 j$ x/ Y( s
7.1富集淘选 % C0 n9 j( H9 M9 M
1) 用筛选抗原包被酶联板（第一轮100µg/ml第二轮10µg/ml第三轮1µg/ml），在96孔培养板中加入100µl溶于包被缓冲液的筛选抗原，一般20个孔，4℃过夜。弃去包被液，PBS洗涤三次，每次洗涤后将孔内液体弃净。 ' l) `) I1 ?* a* O3 y
加100µl含1%BSA 的PBS，室温封闭2 h，弃去液体，PBS洗三次。
/ E7 k% O& h1 }/ q8 @$ i6 S2)封闭后每孔加50µl噬菌体库，37℃温浴2h，吸去未结合的噬菌体库，用TBST洗5遍（第二轮10遍，第三轮20遍）每孔加入50µl甘氨酸-盐酸（PH2.2）室温孵育10min，吸出后加72µl Tris（2 mol/L）中和。中和后加入2ml新鲜制备的XL1-Blue，37℃震荡培养20-30min，取10µL铺板测定库容。余转入200ml 2×YT培养基中，进行第二轮筛选，如此“吸附-洗脱-感染扩增”共筛选3轮。得到富含对筛选抗原有亲和力的重组噬菌体抗体三级库，并对每一轮筛选均测定滴度并计算，作为特异性噬菌体抗体富集的指标。 7 a7 V* u" C9 ]- o, Q# }. L
8 ELISA测定亲和力
" o8 \0 D0 h& ^% s) S5 p将第三轮富集的重组噬菌体感染新鲜的XL1-Blue菌，37℃培养1h后涂板过夜，随机挑选10个单菌落，分别接种于1ml 2×YT培养基中，37℃振荡培养至A600=1.0时加入20倍细菌的辅助噬菌体，37℃振荡培养1h，4000r/min，10min，弃上清，重悬于200ml 2×YT（氯霉素+卡那霉素）37℃培养过夜。离心取上清做免疫学鉴定：各取上清抗体库100µL加入到筛选抗原（1µg/ml）包被的ELISA板中反应1h，同时用PAK100做阴性对照。用TBST洗5遍，加入HRP-M13抗体(抗体做1:5000稀释，用含1%BSA 的PBS稀释)，37℃孵育1hTBST洗5遍后，加显色剂37℃孵育10-15min，加终止液（2mol/L H2SO4），终止反应，测定OD450nm值，高于阴性对照2.1倍以上视为阳性。 , q3 B0 `9 a) p4 V9 I* B
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发表于 2016-9-21 09:14
