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xieyun20052005

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发表于 2016-9-21 09:14 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

天然噬菌体抗体库构建和筛选的实验方法`

一原理
噬菌体展示技术是将外源DNA通过基因工程技术克隆到适当的噬菌体载体9 n! s% `, g# g! O( K
上，使外源DNA片段对应的表达产物融合在噬菌体的衣壳蛋白上形成融合蛋白& |$ ]# S4 j# m; Q% X
呈现在噬菌体表面，被展示的多肽或蛋白可保持相对的空间结构和生物活性。然
后利用靶分子，采用适当的淘洗方法洗去非特异结合的噬菌体，最终从噬菌体文
库中筛选出能结合靶分子的目的噬菌体；外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面; P% m; O: b. p' u1 H9 R. B2 b
而其编码基因作为噬菌体基因组中的一部分可通过噬菌体DNA序列测序出来。该
技术的显著特点是建立了基因型和表现型之间的对应关系。
' C2 O( I) T- m7 E/ F
图不能复制1 i+ Y( S) Y8 w! n, e5 ^

: x. _3 _" E" U7 b" q/ q9 {
二简要操作流程 " B1 j0 a# r" ^1 ]. {1 ?
1. 从标本中提取总RNA。 4 d2 ?; b' s$ B4 e3 {8 Y
2. 合成cDNA。
3. 用PCR方法扩增轻重链可变区基因。
4. 采用SOE-PCR(重叠延伸拼接法)将轻重链可变区基因装配为scFv。 . i* u1 H( c" e
5. Sfi消化扩增的scFv片段。
6. Sfi消化质粒载体PAK100与scFv片段连接。
7. 电转化XL1-Blue大肠杆菌。 5 _' T6 g. `; ~
8. 扩增XL1-Blue大肠杆菌建立噬菌体库。
9. 筛选富集目的scFv。 : _* H; N% J2 U# i* r( ?' x1 [) ^
10.做亲和力鉴定。

二实验材料
1. 材料 8 }  w  v4 R/ u3 X1 C
1.1 菌株、载体和细胞    N5 ]" z) q! e
1) 质粒PAK100、 E. coli XL1-Blue、辅助噬菌体VSCM13为本实验室保存。
1×106 -5×106对数生长期或冻存的杂交瘤细胞或脾细胞自行制备。 4 U, ?# R( d8 k, R3 L
2) 设计与合成引物根据文献《重组抗体21-23设计和合成引物。 / q) |$ d) f+ G- v4 X; p$ u
1.2. 试剂与仪器
TRIZOL( Invitrogen 公司)，AMV-Reverse Transcriptase ( Promega 公司)，WizardPlus
SV Minipreps DNA Purification System ( Promega 公司)，限制性内切酶 Sfi I，T4 连
接酶( TaKaRa公司)，HRP标记抗M13抗体( Promega 公司)、电穿孔仪，Bio-Rad公
司，PCR仪（senscquest公司）。- \' `- k& h% L
1.3缓冲液和培养基的配置
1.3.1缓冲液 ) v4 B  A- N# }0 k, J" b! \1 p
1) 10×PBS(0.1M)：称取80 g NaCI，2 g KCI，20.6 g Na2HP04 12H20，2.4 g KH2P042 {/ M! F9 g: V- J2 _; [3 f
加去离子水至900ml，调节pH值至7.4，定容至1 L，高压灭菌。
PBST：在1×PBS中加入终浓度为0.05%的Tween 20。
3%BSA/PBS：在PBS中加入终浓度为3%的BSA，调PH值7.4，过滤除菌（即6 F5 j, j- |- W. X
用即配不能长期保存）。

2) 20xTBS溶液150ml：称取18.2g Tris-HCl、26.1g NaCl，溶于100ml去离子水，& b7 |, \) u( _6 T- o% W. z
定容至150ml。用时1:20稀释，加0.05%的Tween 20即为TBST，可用于$ v0 K- W1 V" W" t3 d! ?, ]* t- F
洗涤。 9 M6 j6 b0 V- e7 V3 G+ D
3) 5×PEG/NaCl(20%PEG，2.5 M NaCl)：称取200 g PEG 8000和150 g NaCI，用0 B* D1 i$ _) _% H
去离子水定容至1 L，加热溶解，高压灭菌。 ! ]6 J# M0 |5 Q: T
4) 0.2 M GIy/HCI洗脱缓冲液：加入1.5 g甘氨酸至90 ml去离子水中，用浓盐
酸调节pH至2.2，再加入100mgBSA，用去离子水定容至100ml，过滤除菌
4℃保存。
5) 2MTris：242 g/LTris每次配20ml即可。 ' p3 v1 b/ y) \0 H  O
1.3.2培养基 5 K4 P! F% [/ _
1) LB液体培养基：Tryptone 10g，Yeast extract 5g，NaCI 10g，用双蒸水定容至
1000ml，高压灭菌后，4℃保存, + \) g, s! q+ E$ F; {# L% w; V; q* F' Z' f
LB固体培养基：在LB液体培养基中加入琼脂粉至终浓度为1.5%高压灭
菌后4℃保存。
2) 顶层琼脂：每升含：10g Tryptone，5g yeast extract，5 g NaCI，1g MgCl2·6H20，$ `( \( I% {: v
7 g琼脂粉。高7g琼脂粉。高压灭菌，4℃保存，用时微波炉融化。
3) SOB培养基：20 g/L胰蛋白胨，5 g/L酵母提取物，0.5 g/L NaCI，10ml的 250mmol/L的KCl或（186mg的KCl），用去离子水定容至1 L，高压灭菌，冷却后加入10ml 的1mol/L 的 MgCl2 于室温下存放。
SOC培养基：每100ml SOB培养基加入2ml 1mol/L的葡萄糖（过滤除菌）。 7 J* t& h1 }, F) v6 }* V- G7 {2 W0 y
20%葡萄糖：称取20g无水葡萄糖，用双蒸水溶解后定容至100ml，用0.22 u m ,滤膜过滤除菌，-20℃保存。 & I5 p5 B- A$ N/ e- \
1mol/l MgCl2：称取203g MgCl2.6H2O溶于1 L去离子水，高压灭菌（一般配100ml" h( }, |  w" J/ k3 L( C# R
即可）。
4) 2×YT培养基：16 g/L胰蛋白胨，10g/L酵母提取物，5 g/L NaCI，用去离子水定容至1 L，高压灭菌。 6 H/ ?8 r4 ?+ e% d) i4 Q2 u
2×YT培养扳：含15%/L琼脂粉的2xYT。
2×YT-氯霉素葡萄糖培养基板：含30微克/ml氯霉素（1ml培养基加入1.2微升25mg/ml的氯霉素溶液）及2%的葡萄糖2xYT培养板，待冷却至低于50℃时，加入氯霉素贮液，混匀倒平板，平板4℃避光贮存。  G6 N+ S8 |, [5 g$ R4 u$ [2 X! a

三、方法
Notes：接触了噬菌体的器材要160℃消毒3到4小时，噬菌体液体不能污染，否则实验就不能进行下去！ 0 `5 ~8 K; {" {! V  \4 r, v. V, g) D7 p) l
1. 噬菌体及宿主菌的制备 + A; f( Q* b4 v4 M) y* K
1.1辅助噬菌体敏感宿主菌的制备
1) 方法
从-70℃保存的大肠杆菌XL1-blue储存管挑取细菌分区划线接种于含四环素的LB平板，37℃培养过夜。分别挑取单个菌落接种多管2ml SB(含四环素10μg/ml-1)，37℃ 250 r/min，振荡培养至对数生长期(OD600=1，通常5h)。取VCSM13保存液稀释至10-8加分别加2μl到上述大肠杆菌XL1-blue菌液100μl，37℃缓慢震荡20min（80 r/min），加入高层琼脂浇板37℃孵育12~16 h，观察噬菌斑鉴定该菌对VCSM13的敏感性。 8 W2 c  B8 u" o3 M, X9 q- H/ @
2) 实验准备
i. 准备和菌落数相同的LB板，放到37℃预热
ii. 准备0.7%的高层琼脂预先微波炉加热熔化后放入45℃水浴锅中 ' Y9 t5 J: A- J8 L, Q; F
iii. 2ml消毒好的SOB培养管数个
iv. 装45℃水的大烧杯一个，倒上层琼脂时将装0.7%高层琼脂的烧瓶放入
1.2 辅助噬菌体的扩增
1) 方法
辅助噬菌体通常保存于4℃，大量制备时应挑取遗传背景相同的单个空斑扩增，以减少变异株。将1012PFU/ml的VCSM13系列稀释至10-8。取经鉴定对VCSM13敏感的新鲜大肠杆菌XL1-blue（OD600=1）分装成每支100μl，加入稀释的VCSM13 2μl，37℃缓慢震荡20min（80 r/min），分别加入3ml 45℃高层琼脂混匀，立即倒入预热无抗生素LB琼脂板，37℃培养过夜。
吸取经鉴定对VCSM13敏感的XL1-blue 菌，按1:500接种于5mlSOB培养基中，(含四环素10μg·ml-1)，37℃ 220r·min-1振荡培养1 h，挑取辅助噬菌体单个空斑接种入该培养物，继续37℃振荡培养2 h，转入100 ml SB(含四环素10μg·ml-1，卡那霉素70μg·ml
-1，加20%葡萄糖2ml，1mol/l MgCl2，1ml) 37℃220 r·min-1振荡培养过夜。 ' q, i. }$ r7 Y5 s
2) 实验准备：同上 2 M, d( y" z1 M' Y9 A- T5 |' {4 A
1.3 辅助噬菌体滴度的测定 , O# @+ f7 g! I
将上述扩增辅助噬菌体无菌分装50 ml离心管，室温4 000 r· min-1离心15 min，收集上清液，再分装50ml离心管， 4℃保存。用LB稀释VCSM13至10-8，分装OD600为1的大肠杆菌XL1-blue每支100μl，加入稀释的VCSM13, 2μl，37℃缓慢震荡20min（80 r/min），加入3ml 45℃高层琼脂混匀，立即倒入预热无抗生素，LB琼脂板37℃培养过夜计数空斑。 * \7 P$ w+ D. v' v6 U5 j
噬菌体通过噬斑形成单位(plague forming units,pfu)确定滴度。计数方法:0 s* V# {# N3 m1 m$ R# I
3 F5 f+ ]% c- e
经扩增的VCSM13滴度为1×1011~2×1011PFU/ml。
2. 大肠杆菌电转化感受态细胞制备 - z* J1 a9 y& w1 F6 g
2.1第一天：
1) 将适合菌株（如XL1-Blue, DH5α）划板，在37°C下过夜培养  8 Q7 J2 D* h% i' Y( D
2)  高温灭菌大的离心瓶（1000ml）两个，每瓶装200ml的2×YT培养基以备
第二天摇瓶用
3) 1L 10%灭菌甘油或蒸馏水保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细胞用。
2.2第二天
1) 挑单克隆于5ml的2×YT培养基中在37°C下过夜培养
2.3第三天：
1) 取上述过夜培养物按1:100至装有200ml 2×YT的1升三角瓶中，接种两瓶。
2) 37°C下剧烈振荡（220转）培养2-3小时  / K( p  k% C9 ~
3) 定时监控OD600值（培养1小时后每半小时测定一次）  ' `. h8 K) N- H8 a( H
4)  当OD600值达到0.5左右时，从摇床中取出摇瓶，置于冰上冷却至少15分
钟（需要的话这种方式可以存放培养液数小时）
5) 细胞在4°C 2500g（4000转）下离心5分钟，弃上清液（如需要，沉淀可在) Q$ L- B8 }+ X' j& o7 ?
4°C的10%甘油中保存一两天）0 F+ j1 _3 b# j' o+ i
6) 用少量的（约3-5ml）灭菌的冰冷10%甘油重悬浮细胞。然后冰冷10%甘油
稀释至离心管的2/3体积。  7 i# n2 ~; H3 m- W1 r( p
7)  照上面步骤重复离心，小心弃去上清液  ( l) l0 Z4 u! T, I. K# S, S
8) 照上面步骤用灭菌的冰冷10%甘油重悬浮细胞
9) 离心，弃上清液（可以再洗一遍）  " h) n+ y% M+ Y* r8 S1 s) e
10) 用20ml灭菌的、冰冷后的10%甘油重悬浮细胞  ! Q6 |- h0 a+ y  [$ g- Q
11) 照上面步骤离心，小心弃去上清液（沉淀可能会很松散）
12) 用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2-3ml，保证细胞的最终浓度为:稀释100倍后OD600=1
13) 将细胞按50μl-200μl等份装入微量离心管，于-80°C保存
Note：甘油会降低转化效率，如果不冻存，可以用蒸馏水洗，做的过程中要注意低温。 . w  M" w) g7 C; d+ l
3. 转化方法: 7 s3 m  m" F6 `# X& @; F
3.1. 在冰上解冻电感受态细胞添加1-3μl DNA，质粒1ul，连接产物2-3ul，冰上培育约5分钟。
3.2 转移DNA/细胞混合物至冷却后的1mm电穿孔容器（无泡）中  6 s, F" e2 `# z- P
3.3设置电穿条件，准备好300μl LB 或 2xYT  4 X& Q4 t7 }3 e, G0 K4 R/ \
3.4 对电穿孔容器进行脉冲
3.5 立即添加300μl 的LB或2xYT至电穿孔容器中
3.6  37°C下培养细胞30分钟至45min以复原（如果做质粒转化此步骤可以省略）   P0 n1 t$ P5 J" i0 Y0 r) z6 U5 \
3.7转移细胞至适当的固体选择培养基上培养
4 . PCR扩增抗体V区基因 ! S, O5 @# u4 }- Y# t3 Q- B1 X
4.1 混合引物的配制
引物按说明书稀释，稀释引物之前先最大速离心5min，轻轻打开管盖，每6 y+ H4 L3 c* N' Y
管引物加入超纯水的量是OD×10，配成100μmol/ml，充分震荡5min，用时按下/ T- g) `8 O3 S
表加入各种引物，混合在一起，根据实验需要进一步稀释。 5 }+ _$ r, v/ S& S! _0 `
LB1 LB2 LB3 LB4 LB5 LB6 LB7 LB8 LB9 LB10  " u* f" W1 N% W4 W
2    2    3    3    3    4    4    2    2    3

LB11 LB12 LB13 LB14    LB15    LB16    LB17 LBλ' C9 Q+ A2 M: }1 w- z
4    4    4    2       2       2    2    2

LF1    LF4    LF5    LFλ
19    9.5    9.5    2  F% T0 s/ M+ w; q; K
1 s+ v! I4 s4 O7 @) @
HB1 HB2 HB3 HB4 HB5 HB6 LB7 LB8 LB9 LB10
3    3    2    2    4    3    2    3    4    2
* p. L9 i' O$ Q+ j3 b4 T
HB11 HB12 HB13 HB14 HB15 HB16 HB17 HB18 HB19 : d7 O6 f" N6 y5 d$ ^
3    2    2    3    3    3       3    2       2
0 x1 {8 ?2 p- ]6 m! ~
HF1    HF2    HF3    HF4
10       10    10    10' ]$ z( p. U, k) S
Scfor和scback先配成100μmol/ml根据实验需要进一步稀释。

4.1  VH基因扩增 , Q4 [  Q5 N' @& c- Z( P
1) 25µl反应体系
1µl cDNA、2.5µl的10x缓冲液、2.5µl的MgCl2(25mM)、2.5µl的dNTP混合物、1µl 的HB 和1µl的HF，TaqDNA聚合酶0.25µl，补水至25µl。混匀，短暂离心。
2) PCR反应条件为 3 `% z- c. Z' w! J" v2 _
94℃、3min，（ 94℃、30s， 54℃， 57.2℃，60.9℃ 40s， 72℃  40s），30个循环，72℃ 10min。 ( R) ]& g/ j9 n9 N
4.2  VL基因扩增 5 y' ~8 v8 c6 E$ a% O! i
1) 25µl反应体系
1µl cDNA、2.5µl的10x缓冲液、2.5µl的MgCl2(25mM)、2.5µl的dNTP混合物、1µl 的LB 和1µl的LF，TaqDNA聚合酶0.25µl补水至25µl。混匀，短暂离心。
2) PCR反应条件为：同重链 1 R" X$ b* G0 W8 ]$ P! d
4.3  VH和VL PCR产物纯化及浓度测定
用胶回收试剂盒回收VH和VL PCR产物，通过电泳确定回收量。 , a+ P$ N' s; y' }7 q
4.4  scFv的扩增 : `4 t: b6 H# P1 s/ z; x9 z
1) 25µl反应体系： 9 `. M/ j# i$ R/ a& `" I
VH和VL PCR产物 (60ng)、2.5µl的10x缓冲液、2.5µl的MgCl2(25mM)、2.5µl的dNTP混合物、1µl 的scFOR和1µl的scBACK，TaqDNA聚合酶0.25µl，补水至25µl。混匀短暂离心。

2) 反应条件
92℃  3min，（ 92℃  1min，63℃  30s，58℃  1min，72℃  1min7个循环）（92℃  1min，63℃  30s，58℃  1min72℃  1min），25个循环。
4.5． scFv的酶切消化
1)加入下列试剂于无菌微量离心管中：50µl scFv纯化DNA片段、10µl的10xM缓冲液、2µl TaqDNA聚合酶(20Uper reaction)、35µl灭菌双蒸水，总体积100 ul。 6 m' W3 K2 N. O0 g9 ]# ?) P
2)混匀，50℃、2h。加入40µl无水乙醇， 4℃ 1 h。12 000 r/min，10 min，室温挥发乙醇。 : \$ `' f5 G8 ~( V8 z% z0 o) D
经质量测定可用于与相应载体相连接。 ; w( M$ D/ H/ \7 h' [
5  噬菌体抗体库的构建  & n4 d, J1 w5 V
5.1 转化
ScFv片段和载体PAK100经sfiⅠ酶切后，用T4连接酶连接，电转化入X-Blue感受态菌，加培养基（2×YT+2%G）1ml，37℃培养1h后，取实验组转化菌1µl平铺2×YT-氯霉素葡萄糖培养基板，30℃过夜。第二天对稀释菌涂布扳上长出的菌落进行计数，计数实验组转化菌形成的菌落，估算库容，库容量(cfu)=菌落数×稀释倍数，4℃保存平板。
5.2辅助噬菌体挽救文库
1) 取实验组转化菌1ml，加入20ml 2xYT氯霉素葡萄糖培养基中，30℃、200 r/min培养2h或更长时间,至OD600=0.5左右,使细胞处于对数生长期,得以表达F性鞭毛。
2) 加入4×1010pfu的M13K07辅助噬菌体(噬菌体：细菌=20:1)，37℃，静置10 min，250 r/min培养1 h。 , y0 z# L2 b3 u9 j' e/ e+ G+ j. v" x2 r' {
3) 4 000 r/min离心10min,重悬沉淀于200 ml 2xYT氯霉素葡萄糖培养基中,30℃过夜振荡培养。
4) 4 000 r/min离心5 min，收集上清，加入1/5体积量PEG/NaCI,混匀，4℃静置45min。
5) 4℃、10000 r/min离心20min，弃上清，用2m1或4ml PBS重悬沉淀，建立初级scFv噬菌体抗体库。
6 噬菌体抗体库滴度的测定
取不同稀释度的体抗体库溶液2µg加到 100µg XL1-Blue（OD600=1）菌液中，菌液37℃放置20min，铺板，过夜培养，计算集落形成单位（cfu）。
7  目的噬菌体抗体库的筛选 3 t. e9 Y! k: T7 \; {8 V8 Z
7.1富集淘选 " ~: F* C' q& ^
1) 用筛选抗原包被酶联板（第一轮100µg/ml第二轮10µg/ml第三轮1µg/ml），在96孔培养板中加入100µl溶于包被缓冲液的筛选抗原，一般20个孔，4℃过夜。弃去包被液，PBS洗涤三次，每次洗涤后将孔内液体弃净。 , a( e1 h( ^8 X) t( R
加100µl含1%BSA 的PBS，室温封闭2 h，弃去液体，PBS洗三次。
2)封闭后每孔加50µl噬菌体库，37℃温浴2h，吸去未结合的噬菌体库，用TBST洗5遍（第二轮10遍，第三轮20遍）每孔加入50µl甘氨酸-盐酸（PH2.2）室温孵育10min，吸出后加72µl Tris（2 mol/L）中和。中和后加入2ml新鲜制备的XL1-Blue，37℃震荡培养20-30min，取10µL铺板测定库容。余转入200ml 2×YT培养基中，进行第二轮筛选，如此“吸附-洗脱-感染扩增”共筛选3轮。得到富含对筛选抗原有亲和力的重组噬菌体抗体三级库，并对每一轮筛选均测定滴度并计算，作为特异性噬菌体抗体富集的指标。
8  ELISA测定亲和力 # O3 y( p" Y9 D  N; Q
将第三轮富集的重组噬菌体感染新鲜的XL1-Blue菌，37℃培养1h后涂板过夜，随机挑选10个单菌落，分别接种于1ml  2×YT培养基中，37℃振荡培养至A600=1.0时加入20倍细菌的辅助噬菌体，37℃振荡培养1h，4000r/min，10min，弃上清，重悬于200ml 2×YT（氯霉素+卡那霉素）37℃培养过夜。离心取上清做免疫学鉴定：各取上清抗体库100µL加入到筛选抗原（1µg/ml）包被的ELISA板中反应1h，同时用PAK100做阴性对照。用TBST洗5遍，加入HRP-M13抗体(抗体做1:5000稀释，用含1%BSA 的PBS稀释)，37℃孵育1hTBST洗5遍后，加显色剂37℃孵育10-15min，加终止液（2mol/L H2SO4），终止反应，测定OD450nm值，高于阴性对照2.1倍以上视为阳性。 & c  p) a& e* \
7 Y: H! S0 ?, C' \
                  / _( |2 }* F+ s: |2 E! i