microRNA的qPCR结果问题

wzm123hzy

尊敬的老师们，师兄，师姐们：
& g! O8 N2 R" A0 x我做microRNA qPCR时，出现：做了3个内参，其中一个有杂峰，一个无CT值，一个正常。5个unknown里有一个没有CT值，还有一个出现双峰，其余3个正常。求老师们，师兄师姐们，不吝赐教，非常感谢。

zhoujp3651

这样的溶解曲线显然是不对的。引物结合的位点可能不唯一，建议用总DNA先做普通pcr看看条带，或者用cDNA也行。
0 p8 k, d, ~$ a: J* `' A

zhoujp3651

另外起峰循环数最好在15-25之间，30以上是肯定没有意义的。

wzm123hzy

是引物特异性不好的意思吗，可是MicroRNA全长只有20个bp，引物不好设计，另外做的5个重复里有一个没有CT值，是我操作不稳定?

细胞海洋

回复 wzm123hzy 的帖子2 s3 H6 S1 _% W% k2 C: _

3 p7 D& r9 R# k2 T% w) ^你回复谁 就点击对方回复帖子中的回复按钮 然后输入内容 像我这样+ Q- b  P  j1 a- ?. l1 }
6 z7 c3 x  y0 y6 c! _& b/ l# d1 X; g
否则他会看不到

wzm123hzy

回复 细胞海洋 的帖子
2 V$ f- s2 E4 e  O# E5 c% W/ Y4 [* K1 Y3 g
好的，谢谢老师

wzm123hzy

回复 zhoujp3651 的帖子
9 D' u  r5 v8 d( j) _, f/ {' N* k6 v! [, H1 x3 }" k6 t6 x
老师，您好，请问是引物特异性不好的意思吗，可是MicroRNA全长只有20个bp，引物不好设计，另外做的5个重复里有一个没有CT值，是我操作不稳定?2 o5 H, a6 H3 W4 U

Yedan

; M6 h5 g. a9 x/ [) Y! ?

$ l: B# Z& L  r/ n回复 wzm123hzy 的帖子
# N  U" V8 n, W4 @! M- N
& B: R5 m; Z0 Q7 c( xmiRNAs的定量检测引物不是针对那20bp左右的序列设计引物的，在你做反转的时候，就会把miRNA成熟序列加长，要么是用针对每个miRNA特异的反转引物，要么用Oligo，检测的时候产物长度会加长到90bp左右（每个公司的kit不同），所以你看你每对引物的溶解峰温度，就知道PCR对不对，再者跑完的PCR产物可以跑个2%胶，如果条带单一位置正确，说明你的PCR没问题。

wzm123hzy

回复 Yedan 的帖子% S4 j5 o) G, m
! r2 p; Q4 E! r, p, ?# T6 V! a1 I
好的，谢谢老师。我再跑个2%的胶试一下。