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[p=24, null, left]导读：[color= ] " v5 h+ j4 M/ o2 V/ I
靶向CD19的CAR修饰的T细胞在B细胞恶性肿瘤中有抗肿瘤活性。然而由于淋巴细胞清除性化疗和CAR-T细胞产品不一致性，很难确定影响该治疗方法毒性和有效性的相关因素。美国西雅图弗雷德哈钦森癌症研究中心的Cameron J. T团队最近在Science Translational Medicine上发表了一项临床试验结果：在环磷酰胺(Cy)联合或者不联合氟达拉宾(Flu)为基础的淋巴清除性化疗(Cy/Flu或者Cy)后，将CD4+ T细胞和CD8+ T细胞以1：1的比例配方生产出标准一致的CAR-T细胞产品，用于治疗32位复发/难治型B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)的患者。接受Cy/Flu的病人与接受Cy的病人相比，CAR-T细胞的扩增和持久性明显增加，并且表现出更高的反应率 [50%完全反应率(CR)，72%总体反应率(ORR)]，CR率在最大耐受剂量时为64%(82%ORR;n=11)。Cy/Flu减少了CAR结构中鼠源scFv引起的免疫反应，该反应限制了CAR-T细胞的扩增和CAR-T在临床上对仅接受Cy病人的治疗有效性。严重的细胞因子释放症(sCRS)和≥3级的神经毒性分别在13%和28%的病人中出现。在该CAR-T细胞产品回输1天后，血清里的生物标记物浓度与后续的严重细胞因子释放症(sCRS)和神经毒性呈相关性。按CD4+/CD8+ T细胞比例进行配方生产的CD19 CAR-T细胞免疫治疗可以确定影响CAR-T细胞扩增、持久性和毒性的相关因素，从而加速淋巴清除治疗方案的优化，以促进疾病反应和无进展生存期。 . L/ ? t$ J7 q0 T0 ]' o
淋巴细胞清除性化疗，结合过继回输自体细胞制备的靶向CD19的CAR-T细胞，在难治性B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)表现出极高的完全反应率(CR);然而，对于难治性非霍奇金性淋巴瘤(NHL)的治疗效果却差强人意。人类的CD4+和CD8+T细胞是T细胞的不同亚群，这两种细胞亚群在增殖、体内的持续性和在体外扩增后再过继回输的抗肿瘤效果均有所不同。临床前研究表明，来源于CD4+或者CD8+中央记忆T细胞(TCM)或者初始T细胞(TN)比来源于效应记忆T细胞(TEM) u- o5 i! `2 e$ u* `
)生产的CD19 CAR-T细胞产品有更强的清除CD19+肿瘤的能力。通过固定CD4+/CD8+ T细胞的比例配方形成的CAR-T细胞产品，比其中任一亚群或者不考虑亚群组成的T细胞产品效果更强。CAR-T细胞亚群组成的不一致性在治疗NHL病人的临床试验中，对于辨别与CAR-T细胞的扩增、持久性、抗肿瘤反应的质量和持续能力，以及CAR-T细胞治疗毒性相关的因素是一个极大的挑战。通过固定亚群比例来进行基因修饰，能生产出更加统一的CAR-T细胞产品用于临床，使体内活性可重复，促进与有效性和毒性相关因素的鉴定。
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B细胞恶性肿瘤病人的自体CAR-T细胞生产由于病人出现淋巴细胞减少症和T细胞增殖能力受损而面临巨大的挑战。在一些临床试验中，利用自体T细胞对于体外抗CD3/CD28磁珠刺激的增殖能力，来预测CD19 CAR-T的生产质量，并确定病人可参与临床试验的资格。使用该方法，24%的B-ALL病人在临床试验被排除试验，NHL病人的排除比例更高，从75%至100%，这取决于收集T细胞时病人疾病的状态。Cameron J. T团队提出新策略，通过血细胞分离分别获得CD4+和CD8+ T细胞亚群，导入CD19 CAR，在体外用辐照的CD19+的EB病毒(EBV)刺激的淋巴样干细胞(LCL)来选择性加强转导基因后的T细胞扩增能力，并在淋巴细胞清除性化疗后给药。这种策略生产的CAR-T细胞产品组成明确，用于治疗复发/难治性NHL且经历过多次预先治疗的病人是可行的，不会由于淋巴减少症或者体外扩增的检测结果排除任何病人。固定组成的CAR-T配方还可以辨别出与CAR-T细胞扩增、体内持久性、毒性、临床反应的相关因素，从而能够优化淋巴细胞清除方案，以促进疾病反应和总体的无进展生存期。 9 @8 y5 r: K2 d: \) p
 NHL病人T细胞亚群的异质性
在白细胞分离前，对CD4+和CD8+天然和记忆T细胞亚群在每个病人血液中比例进行评估(图1)，结果表明，NHL病人的CD4+和CD8+ T细胞与健康个体相比绝对数量要低，而且比例的变化更大。在这些NHL病人血液中有更高比例的终极分化TEM/EMRA
( ]8 B/ i+ Q: o+ e q3 }，因此可以从白细胞分离产品选择性分离T细胞亚群，进行CAR修饰并按比例配方形成CD19 CAR-T细胞产品。
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: j1 o6 b9 t* m" Q: r6 e7 f" q图1：健康人与NHL病人的T细胞亚群比例差异 [p=25, null, center]$ D' a- k/ U$ ~
) m- i% h0 @9 Q; }[p=25, null, left] CD19 CAR-T细胞生产流程[p=25, null, left]+ E. {# ]( M1 ]. n
病人进行白细胞去除术后，并没有产生任何严重的不良反应。CD4+和CD8+ T细胞通过Clini MACS筛选白细胞中富集，进行CAR-T细胞生产。使用免疫磁珠细胞筛选，从所有病人分离的白细胞得到高度富集的CD4+ T细胞进行CAR生产。在血液中CD8+ TCM细胞数量多的病人用CD8 +TCM
/ b) X( r4 @# O: i( t细胞进行CAR-T细胞生产。CD8 TCM细胞数量少的，出现严重淋巴减少症的，或者高度血液淋巴瘤负担的病人，选择CD8+ T细胞比例更大的亚群进行CAR转导。筛选的CD4+和CD8+ T细胞用编码CD19 CAR和截短的EGFR(EGFRt)的慢病毒载体进行转导，以方便用EGFR单抗cetuximab进行流式检测。转导的EGFRt/CD4+和EGFRt/CD8+ T细胞用辐照的同种异体CD19+ LCL细胞系进行刺激。在产品配方和发布时，LCL刺激极大增加了CAR-T细胞的数量，使CAR-T细胞产品可用于所有病人。
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7 G9 g6 q C* L# Q# E: a9 I6 ?图2：CD19 CAR-T生产流程
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接受Cy/Flu的病人的CAR-T细胞治疗效果更佳 在所有参与试验的病人中，更强的CAR-T细胞扩增和更长的持久性可能与肿瘤消退相关。Cy/Flu后回输2x106/kg的CAR-T细胞可以作为NHL病人的最佳方案，因为与2x107/kg的剂量相比毒性更低，并且在不同组织中的具有抗肿瘤活性。以2x106/kg剂量治疗的病人与Cy治疗的病人相比，总存活率和无进展生存期均更高。 + u7 a1 c" Y! {$ V- S9 T& j" ~6 _ r9 b, R
图3：接受Cy/Flu与Cy病人的总存活率和无进展生存率对比 " {7 W) R7 B! T8 i& s! E
CD19 CAR-T细胞治疗的毒性 CD19 CAR-T细胞治疗与毒性相关，因此对于毒性最高风险的预测在本领域引起极大兴趣。通过组成一致的CAR-T细胞和Cy/Flu治疗以减少抗CAR免疫反应，揭示了细胞剂量和CAR-T细胞体内扩增的相关性，可促进细胞剂量的优化和更好的评估治疗效果。由于CAR-T细胞导致的严重毒性主要发生在2X107/kg的剂量。减少剂量可以降低毒性，CR和ORR分别达到64%和82%，明显优于最近报道的45%。尽管以优化剂量给予一致的CAR-T细胞产品，少数病人仍会由于特异性的生理区别发生严重的毒性，例如，由于细胞因子和细胞因子受体基因的多态性。在CAR-T细胞回输一天后的NHL病人血清中， IL-6，IL-8，IL-10，IL-15和IFN-γ的高浓度与随后发生的sCRS和神经毒性相关， TGF-β的低浓度与神经毒性相关。血清IL-6和IFN-γ浓度还与接受了Cy/Flu和CAR-T细胞治疗的B-ALL病人随后的毒性相关，但是目前仍不清楚这些细胞因子是否可以在B-ALL病人中可以和在NHL病人中一样预测毒性。通过CAR-T回输1天后对后续毒性相关的生物标志物的检测，提供了未来临床试验中通过早期干预来抑制细胞因子释放或者阻断细胞因子受体，从而在高风险病人中缓和毒性的机会。
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[p=25, null, left]一孔之见：
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本研究通过调整CD4+/CD8+ T细胞比例，配方形成组成一致的CD19 CAR-T细胞产品，联合Cy/Flu的淋巴细胞清除治疗用于NHL病人获得了很好的效果，同时使细胞剂量与治疗效果相关，毒性可以预测，可以更好的优化治疗方案并控制毒性的发生。该策略突破的CD19 CAR-T细胞在NHL病人或者经历过多次预先治疗的病人，由于淋巴细胞减少症或者扩增能力下降而导致的使用限制，并且进一步加强了细胞治疗用于病人的安全保障。
4 u$ ~) b# K' P! R3 q' _7 i o文章来源：Science Translational Medicine 编译：Jenny King | 
发表于 2016-10-5 10:07
