基因编辑培育出首例白化西藏小型猪

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基因编辑培育出首例白化西藏小型猪& [" m0 A1 \( r0 P1 g' `
来源:广州日报 / 作者: / 2017-01-18
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5 @) m) ~* u/ \3 k8 Y- W从南方医科大学获悉，该校实验动物中心科研团队运用 CRISPR/Cas9 基因编辑技术，成功培育出世界首例白化西藏小型猪，同时敲除了与免疫相关的基因，这标志着自主构筑的基于小型猪受精卵制备基因修饰猪的平台取得了突破性进展。而在此之前，全世界尚未有纯白藏猪的先例。; a# v( c. D3 A
藏猪作为我国独有的高原特殊品种，全身被毛为乌黑或黑灰色，少数个体为棕色，皮肤为浅黑色。南方医科大学实验动物中心主任顾为望在接受采访时谈到，作为引进西藏小型猪研究的倡导者和发起人，他和其他专家于 2003 年在西藏考察时，发现藏猪不仅体形小，而且高原抗应激能力强，于是引进了这一品种。南方医科大学成为了广东省第一家实验用小型猪生产许可证的单位。第一次完全利用自身科研团队，独立研发世界首例白化西藏小型猪。* q5 O2 U0 j1 O
这次世界首例白化西藏小型猪的成功培育，所采用的技术路线是 “同步发情、人工授精、同步取卵、受精卵移植”，受精卵在体外进行基因修饰，敲除白化相关基因及免疫相关基因，然后进行胚胎移植。目前出生仔猪白化表型明显，而免疫缺陷表型有待进一步鉴定。
5 _' f( S5 q* ], R3 Y9 M% a9 N: y$ @据悉，猪的消化系统、心血管系统、代谢过程等解剖结构以及生理功能和人类特别接近，是一种理想的实验动物。猪在临床实验已有多个突破。用猪可以生产出人用生物活性物质，如胰岛素是人体最重要的影响代谢的激素之一，而猪的胰岛素与人相比只差一个氨基酸，通过提纯之后不需要进行改造，直接可以注入人体以治疗糖尿病。
7 ]1 q! R1 t, C4 v8 r7 ~在临床医师的技能培训和实验研究中，都广泛运用猪做实验动物，就临床而言，医院的骨科、耳鼻喉、眼科、整形等众多科室研究中都会陆续运用到这些技术和方法。
6 S1 C5 ?) R8 Y" L$ k) t3 t' K据悉，该团队接下来将致力于把白化藏猪做成免疫缺陷猪，有免疫缺陷的动物可以把人的肿瘤细胞原位或异位移植到体内，然后进行发病机理研究、临床疗效观察及药物开发。. d& Q9 A7 m" O! r( }! K. c0 C
这只猪厉害了！未来人体细胞甚至器官都有可能来自它——南方医培育世界首例白化西藏小型猪
( m0 B$ ]8 s7 t4 ^' w记者王倩、通讯员黄瑶报道：提起猪对人的贡献，从肉到骨和我们的生活密不可分，不仅如此，猪在医学领域的作用也非常重要，去年，中国自主研发的生物工程 “猪角膜” 已经成功为江西一名 14 岁少年恢复光明。不过科学家们对猪的期待还远不止这些，日前，南方医科大学实验动物中心科研团队运用 CRISPR/Cas9 基因编辑技术，成功培育出世界首例白化西藏小型猪，这种猪的厉害在于，经过改造后它成为最优良的医学实验动物，最适合大量繁殖并高度接近人的特性让它可能成为新的人体细胞工厂，甚至进行器官异种移植。5 x+ j, q$ {/ D& u. G
南方医实验动物中心与中科院广州生物医药与健康研究院赖良学研究员（世界第一例体细胞克隆猪创制人）一直多有合作，他们于 2007-2010 年期间利用西藏小型猪克隆技术已成功培育出不同的转基因体细胞克隆猪，包括红、黄、蓝、绿四色荧光蛋白转基因克隆猪等。两家单位共同申报的 “大动物基因修饰技术研究及基因修饰动物模型的建立” 项目于 2014 年获得广州市科学技术进步奖一等奖；2016 年，“猪基因突变技术创新及基因修饰猪模型的建立” 又获得广东省科学技术一等奖。
5 ]" y3 U# J- t* L8 }8 G作为引进西藏小型猪研究的倡导者和发起人，南方医实验动物中心主任顾为望表示，此次培育成功的白化西藏小型猪同时敲除了与免疫相关的基因，并且可以迅速实现大规模繁殖，并且对于实验动物学、生物医药以及临床医学研究等领域都具有重大意义。; X# d6 ^% |& Y6 Y
记者在实验动物中心看到，通过人工辅助生殖技术，科学家将原始猪种的受精卵取出，进行基因修饰，然后植入 “代孕猪妈妈” 体内，最终产出 4 只小猪，从外观上看，有 2 只有天然的黑色转为白化。饲养工作人员告诉记者，如今它们成长得很健康，几个月后就可以达到性成熟，并可以进行自然繁殖，继续生出携带白化基因的小型猪。
  J6 B/ m7 e. }9 L为什么是猪？& ~2 P+ c+ a; ^6 R+ W
猪比鼠像人比猴子更便宜
, D4 B3 x: {" [# s) f在常用的实验动物中，鼠类、兔类、犬类和灵长类动物都很常用，但科学家们也发现，新药研发要求必须用两种以上的动物做实验，其中一种需为非啮齿动物。鼠类等啮齿类动物和人类相差甚远；猴子繁殖率低，成本又太高，做实验受到很大限制；犬作为宠物，和人情感太亲密也常常受到人们的心理抗拒。而猪被人长期豢养，已经成为与人类非常相近的一种动物，尤其是猪的消化系统、心血管系统、代谢过程等解剖结构以及生理功能和人类特别接近，是一种理想的实验动物。同时，猪作为传统定义上的食用动物，用它来做实验更容易被人们所接受，这个尤其符合国际上通行的动物实验的福利和伦理要求，实验结果容易被国际社会所认同。% o: A5 }0 J; h+ M
“普通的家猪主要缺点在于体型过大，常常达到五六百斤，在新药研发实验过程中，用量和人差异太大，实验室饲养操作也比较困难。” 因此顾为望认为，成年体重在 30 公斤左右的小型猪是更为理想的实验品种。
* O7 l* o$ k+ x" |为什么要白？* Y- @% E0 _2 |% _
白色皮肤更便于医学观察% N& B  h" w2 e6 Q2 J- F  B
大多数常用实验动物如豚鼠、大鼠、小鼠、兔子，大多是白化品种品系，因为白色动物更加便于观察它的发热、过敏、炎症等症状以及皮肤角膜等损伤与修复的过程，这同样也是白化藏猪的优势所在。0 @1 {6 f/ u" z0 B% [. w3 ~! Q  i- T# Y
顾为望告诉记者，由于猪的皮肤和人非常相似，下一步，还计划将白化藏猪培育成无毛白化藏猪，用于化妆品的研究开发和应用，研究化妆品对皮肤的刺激性和抗皱、防衰老等功效；还可以用于皮肤用药的效果观察或皮肤用药研究。
6 G4 E: m/ a6 C# p; @# |基因如何修饰？
8 X$ j3 m9 T& ^: T, c# e' I这次所采用的技术路线是 “同步发情、人工授精、同步取卵、受精卵移植”，受精卵在体外进行基因修饰，敲除白化相关基因及免疫相关基因，然后进行胚胎移植。目前出生仔猪白化表型明显，而免疫缺陷表型有待进一步鉴定。
% E9 |' q6 @( `. R& V$ `! W顾为望表示，此次实验是南方医实验动物中心科研团队完全利用自身科研团队独立研发，最大亮点是运用最新基因编辑技术 CRISPR/Cas9，设计和制备 sgRNA，基于小型猪受精卵制备基因修饰猪，在世界上获得首例白化、同时敲除了免疫相关基因的实验用西藏小型猪。与转基因克隆猪相比，运用受精卵基因修饰获得的转基因猪的优势在于可以迅速实现大规模繁殖，批量生产供应实验研究用。
% Y  B2 |7 s5 b5 K6 {9 G实验猪能做什么？
/ {9 v0 N! m' g: |* N; ]实验用猪可以生产出人用生物活性物质，如人的胰岛素、凝血酶原、白蛋白。另外，还可以用猪的神经干细胞治疗帕金森综合症、老年性痴呆。4 ?' }9 ~) g% S) E- o* c; ~+ C
顾为望说，他们将首先把白化藏猪做成免疫缺陷猪。一般情况下，人类肿瘤细胞在动物身上接种一般很难成活，但是有免疫缺陷的动物可以把人的肿瘤细胞原位或异位移植到体内，然后进行发病机理研究、临床疗效观察及药物开发。: {$ R; X' }3 E( A+ a  \
他们将利用小型猪动物模型进行诊断、干细胞治疗和肿瘤防治，培育出有高血糖、先天性心脏病、辐照损伤等疾病的动物模型。譬如，可以用基因改造的办法把免疫缺陷猪的肝脏做成条件性损伤的肝脏，再把人的干细胞体外分化后注入猪体内，让猪的肝脏生长出人的肝细胞，用来治疗肝脏疾病；另外用猪生产的人源化干细胞做成的生物人工肝可以更有效地治疗肝衰，猪产生的人的肝细胞在新药研究开发中有广阔的市场前景。
5 I3 X/ ]9 ?/ E5 X4 |猪器官怎么用？
3 X3 H) k/ U& I- M# [在异种移植领域，猪是最有希望成为人的异种移植供体的动物。在组织移植、瓣膜、角膜和皮肤移植领域，医疗方面有广泛的实验，用猪的瓣膜修补人的心脏瓣膜缺损，已经在临床上大规模运用。角膜移植也已经进入临床实验研究阶段，通过移植猪的角膜，修补治疗病人的角膜缺损，可以使其视力恢复到 0.4 以上。另外，猪的皮肤和人特别接近，把猪皮经过处理后作为良好的创口覆盖物，使人的受创皮肤自动愈合，用猪皮做基因工程皮肤已处在实验研究向临床过渡阶段。把猪皮脱去细胞，然后覆盖上人的皮肤干细胞，做成组织工程皮肤，用于治疗大面积的烧伤、冻伤和化学品灼伤。6 |/ n: E2 ]" d) G/ g$ _1 L$ G; y
在器官移植领域，全世界只有 5% 的人可以得到肾、肝、心、肺等供体，绝大部分人只能在等待中濒临死亡。最终能够解决这一问题的就是异种移植。2008 年，第一个基因敲除克隆猪经过基因改造之后，猪肾脏成功移植到狒狒身上，使狒狒存活了 83 天；猪心脏移植到狒狒身上则存活了 179 天。目前，又有科学家将基因改造猪的心脏移植到狒狒体内，而这次存活的时间达到 945 天。
  a  X2 J" }1 @. k+ z! ?7 w日前，我校实验动物中心科研团队运用 CRISPR/Cas9 基因编辑技术，成功培育出世界首例白化西藏小型猪，同时敲除了与免疫相关的基因，这标志着自主构筑的基于小型猪受精卵制备基因修饰猪的平台取得了突破性进展。而在此之前，全世界尚未有纯白藏猪的先例。这项突破性成果不仅可以迅速实现实验用白化西藏小型猪的大规模繁殖，并且对于实验动物学、生物医药以及临床医学研究等领域都具有重大意义。& n: W+ [2 i4 o, R( g/ v
国内首次引进藏猪研究，列入科技援藏项目标志性成果 藏猪作为我国独有的高原特殊品种，主要分布于我国青藏高原的农区和半农半牧区，是世界上分布于海拔最高地区的猪种，能适应恶劣的高寒气候和以放牧为主的低饲养条件，是藏族牧民驯化当地野猪形成的群体。
5 ?8 N# {* d0 ]) R藏猪头型、体重、体型与当地野猪相似，全身被毛为乌黑或黑灰色，少数个体为棕色，皮肤为浅黑色。肌肉发育良好，体型紧凑，体质结实，免疫力强。, ?1 b5 n4 a: o% l- Z; O
实验动物中心主任顾为望在接受采访时谈到，作为引进西藏小型猪研究的倡导者和发起人，他和其他专家于 2003 年在西藏考察时，发现藏猪不仅体型小，而且高原抗应激能力强，于是引进了这一品种。我校成为了广东省第一家实验用小型猪生产许可证的单位，同时也是中国实验动物学会实验小型猪专业委员会主任委员单位。藏猪也成为国家科技部认可的实验动物品种，被列入公共服务平台建设范畴。2010 年 1 月，我校成功主办首届国际小型猪学术论坛；2011 年 11 月 25 日在东莞松山湖召开第二届国际小型猪学术论坛；今年 8 月 21 日，第三届国际小型猪学术论坛也在广州珠江宾馆如期召开。
/ [' S. ]; Y, l# X( ]! W; w6 d学校实验动物中心与中科院广州生物医药与健康研究院赖良学研究员（世界第一例体细胞克隆猪创制人）进行合作，于 2007-2010 年期间利用西藏小型猪克隆技术已成功培育出不同的转基因体细胞克隆猪，包括红、黄、蓝、绿四色荧光蛋白转基因克隆猪、亨廷顿舞蹈症的转基因克隆西藏小型猪和 Mx1（抗黏液病毒 1）转基因克隆西藏小型猪等。两家单位共同申报的 “大动物基因修饰技术研究及基因修饰动物模型的建立” 项目于 2014 年获得广州市科学技术进步奖一等奖；2016 年，“猪基因突变技术创新及基因修饰猪模型的建立” 又获得广东省科学技术一等奖。
3 _: T- s4 |: C$ ^  S$ N8 K  O+ _. k广东省科学技术厅、广州市科技创新委员会把我校对藏猪的研究列入了科技援藏项目的标志性成果，并给予了支持和鼓励。实验动物中心申请的 “构筑制作遗传工程小型猪的社会化服务支撑平台” 被列为广东省科学技术厅资助重点攻关项目，并予以经费支持。实验动物中心于 2015 年被广东省科技厅授牌成为 “广东省实验小型猪种质资源暨检定用小型猪工程技术研究中心”。此外，广州市科创委把藏猪异地保种和实验动物化培育及相关研究列为广州市科技援藏项目，数次予以经费支持。
7 b- K0 j9 ^; d# }/ K4 N7 ]第一次完全利用自身科研团队，独立研发世界首例白化西藏小型猪
' G1 Z4 k. Y' p1 ]% n我校专家利用西藏小型猪进行基因改造，取得了良好的实验效果。在此之前，藏猪仅仅是一种服务于食品领域的动物，如今培育成实验用西藏小型猪被广泛应用于实验动物学、生物医药大健康服务以及临床医学研究等领域。
# r( g! H8 Q% z" A. X" N这次世界首例白化西藏小型猪的成功培育，所采用的技术路线是 “同步发情、人工授精、同步取卵、受精卵移植”，受精卵在体外进行基因修饰，敲除白化相关基因及免疫相关基因，然后进行胚胎移植。目前出生仔猪白化表型明显，而免疫缺陷表型有待进一步鉴定。
3 j) L+ K$ n6 ^% W顾为望指出，此次实验和以往不同，之前学校实验动物中心是和国内其他优秀的技术团队合作，并整合双方的技术力量和动物资源进行研发。而此次实验是我校实验动物中心科研团队完全利用自身科研团队独立研发，最大亮点是运用最新基因编辑技术 CRISPR/Cas9，设计和制备 sgRNA，基于小型猪受精卵制备基因修饰猪，在世界上获得首例白化、同时敲除了免疫相关基因的实验用西藏小型猪。与转基因克隆猪相比，运用受精卵基因修饰获得的转基因猪的优势在于可以迅速实现大规模繁殖，批量生产供应实验研究用。
$ @) X1 f1 V$ v# @. o1 W参与此项实验的是一支技术精湛的科研团队，该团队主要科研成员包括顾为望教授带领的在读博士及硕士研究生刘薇、陈傍柱、顾鹏、刘玉敏、别亚男以及肖东研究员带领的硕士研究生刘宇等。其中，陈傍柱因为学习努力、刻苦钻研，被破格获准硕博连读，他和顾鹏、刘玉敏等人对白化西藏小型猪进行 24 小时视频监控，并详细记录，精心照料。刚刚诞生的四个 F0 代猪宝宝（两头白色一雌一雄、一头花白色、一头黑色）目前发育良好。; A0 f, [. |8 l/ h7 `2 x  _
对话专家 Q&A
& q$ ^2 J% \4 H% D# K* XQ：顾主任，为什么想到要用猪这种动物作为实验动物的首选？
* a# l& Q0 q- VA：猪被人长期豢养，早期和人类生活在同一个屋檐下，吃住在一起，是与人类最相近的一种动物。尤其是猪的消化系统、心血管系统、代谢过程等解剖结构以及生理功能和人类特别接近，是一种理想的实验动物。# ^* I, @8 w/ [
新药研发要求必须用两种以上的动物做实验，其中一种需为非啮齿动物。在进行药物安全性评价时，常用大鼠做实验，但大鼠和人的亲缘关系较远，很多新药用大鼠做毒性实验时是安全的，但进入临床实验往往不成功。通过移植干细胞治疗肝硬化、酒精肝、肝损伤等实验虽已经在大鼠身上取得成果，但由于大鼠的肝脏再生能力强，不能完全说明问题，这就需要用大动物进一步进行实验验证。临床前实验用非啮齿实验动物主要包括犬、猴、猪。猴子繁殖率低，成本又太高，做实验受到很大限制；犬作为宠物，和人情感太亲密也常常受到人们的心理抗拒。所以猪作为传统定义上的食用动物，用它来做实验更容易被人们所接受，这个尤其符合国际上通行的动物实验的福利和伦理要求，实验结果容易被国际社会所认同。, H8 z6 W5 L9 c* @& \7 I) D
Q：临床上用猪来做实验，已经在哪些方面取得了一定的成果？ A：猪在医学研究中具有非常重要的意义，主要涉及以下多个领域。* ~* j3 x& f2 l3 r& b5 s9 U/ v! ~
用猪可以生产出人用生物活性物质，如胰岛素是人体最重要的影响代谢的激素之一，而猪的胰岛素与人相比只差一个氨基酸，通过提纯之后不需要进行改造，直接可以注入人体以治疗糖尿病。赖良学团队已经通过基因编辑技术，使得用猪生产出的胰岛素和人的胰岛素一模一样；从猪血中可以提取凝血酶原及其激活物做成医用止血封闭剂；并且最近报道用猪可以生产出人的白蛋白。在异种移植领域，猪是最有希望成为人的异种移植供体的动物。通过移植猪的胰岛细胞治疗人的糖尿病，已经进入临床实验阶段，目前在上千例接受猪的胰岛细胞移植的人身上还未发现有明显副作用。另外，还可以用猪的神经干细胞治疗帕金森综合症、老年性痴呆，猪的神经干细胞移植被用于治疗帕金森病和阿尔茨海默病也已经在猴子、狒狒身上取得了明显疗效。2 z1 M* g( w3 x. X! ~" z1 f# A
在组织移植、瓣膜、角膜和皮肤移植领域，医疗方面有广泛的实验，用猪的瓣膜修补人的心脏瓣膜缺损，已经在临床上大规模运用。角膜移植也已经进入临床实验研究阶段，通过移植猪的角膜，修补治疗病人的角膜缺损，可以使其视力恢复到 0.4 以上。另外，猪的皮肤和人特别接近，把猪皮经过处理后作为良好的创口覆盖物，使人的受创皮肤自动愈合，用猪皮做基因工程皮肤已处在实验研究向临床过渡阶段。把猪皮脱去细胞，然后覆盖上人的皮肤干细胞，做成组织工程皮肤，用于治疗大面积的烧伤、冻伤和化学品灼伤。
. ^. ^9 p3 @: v) z/ K0 D+ o在器官移植领域，全世界只有 5% 的人可以得到肾、肝、心、肺等供体，绝大部分人只能在等待中濒临死亡。最终能够解决这一问题的就是异种移植。2008 年，第一个基因敲除克隆猪经过基因改造之后，猪肾脏成功移植到狒狒身上，使狒狒存活了 83 天；猪心脏移植到狒狒身上则存活了 179 天。目前，又有科学家将基因改造猪的心脏移植到狒狒体内，而这次存活的时间达到 945 天。
% h" m$ w8 H1 h4 C" k- b( @3 u在临床医师的技能培训和实验研究中，都广泛运用猪做实验动物如心脏导管支架实验、微创手术和介入治疗等。就临床而言，医院的骨科、耳鼻喉、眼科、皮肤、整形、心血管、糖尿病、内分泌、影像、微创介入、肝胆外科等众多科室研究中都会陆续运用到这些技术和方法。; d/ s! O6 _8 G+ V
Q：那么藏猪相比家猪和其它类型的猪而言，它的优势体现在哪里呢？而培育出的基因修饰白化西藏小型猪的独特优势又是什么？$ D& B3 b% }. [% y
A：家猪体型太大，做实验和药物研究都不太好操作，用药量太大，在新药研究的时候，实验室制备（合成、提取或表达）往往数量少，价格昂贵，不利于进行研究；而且长期观察需要几个月甚至一年，其要求饲养成本太高，饲养空间太大，动物质量难以控制。
9 o8 `/ N& o0 o  W藏猪体型小，体质好，抗应激能力强，成本低，用药量少，便于操作和长期饲养观察。经过改造后带免疫缺陷的实验猪，如果养在普通环境下很难存活。我们要把它养在 SPF (Specific Pathogen Free，无特定病原体) 环境下，所有的饲料、饮水、垫料全部经过严格消毒灭菌，24 小时不间断空调，每小时全新风换气 15 次，室外空气需要经过初消、中消、高消三级过滤，更好地控制实验用小型猪的质量，从而提高科研水平，使科研结果的准确性、科学性、可重复性大大提高。
8 n1 A4 p* m7 F9 o在此之前全世界尚未有纯白藏猪，我们通过基因改造，把藏猪做成白化品种，对于实验动物学有着十分重要的意义。我们知道，大多数常用实验动物如豚鼠、大鼠、小鼠、兔子，大多是白化品种品系，因为白色动物更加便于观察它的发热、过敏、炎症等症状以及皮肤角膜等损伤与修复的过程，这同样也是白化藏猪的优势所在。1 L5 X; l, H) W3 I. Q# j% Y8 t
Q：我们下一步的研究方向是什么？; S" l5 t, M' L, s1 Z$ y/ M
A：接下来，后续的研究工作主要有以下三个方向。
' x- @) k8 n! \7 X- L3 C2 t一是把白化藏猪做成免疫缺陷猪。一般情况下，人类肿瘤细胞在动物身上接种一般很难成活，但是有免疫缺陷的动物可以把人的肿瘤细胞原位或异位移植到体内，然后进行发病机理研究、临床疗效观察及药物开发。
* t9 c! c1 W/ w, @4 ^3 |, _' F我们利用小型猪动物模型进行诊断、干细胞治疗和肿瘤防治，培育出有高血糖、先天性心脏病、辐照损伤等疾病的动物模型。譬如，我们可以用基因改造的办法把免疫缺陷猪的肝脏做成条件性损伤的肝脏，再把人的干细胞体外分化后注入猪体内，让猪的肝脏生长出人的肝细胞，用来治疗肝脏疾病；另外用猪生产的人源化干细胞做成的生物人工肝可以更有效地治疗肝衰，猪产生的人的肝细胞在新药研究开发中有广阔的市场前景。
1 l# i" [! `/ n/ Z/ A3 i+ Y9 t二是把白化藏猪培育成无毛白化藏猪，用于化妆品的研究开发和应用，研究化妆品对皮肤的刺激性和抗皱、防衰老等功效；还可以用于皮肤用药的效果观察或皮肤用药研究。' X5 y. e" k7 ^- U/ E
三是与其他学科领域专家不同的是，实验动物学专家更侧重培育可以在生命科学领域或是医学各个临床学科普遍推广应用的实验动物新品种品系，比如白化、无毛、免疫缺陷和微型猪等实验用猪。
3 E5 V( K% f# h9 V) g& P1 v在主持 “广东省实验小型猪种质资源暨检定用小型猪工程技术研究中心” 项目的基础上，我们正在申报 “国家实验小型猪种质资源暨检定用小型猪工程技术研究中心” 培育项目，如若立项，有望在 2-3 年内获得国家级小型猪工程技术研究中心。另外我们翻译的《小型猪在生物医药研究中的应用》这本国外著作本月即将出版，相信对国内同行应用小型猪进行科研和教学会有所帮助。
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