甲基化与 lncRNA: 表观遗传学与转录组学研究的完美结合

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甲基化与 lncRNA: 表观遗传学与转录组学研究的完美结合/ q/ X( ]8 S! b! N8 Z: w& G: h0 \
来源:上海伯豪生物技术有限公司 / 作者: / 2017-01-207 G7 E3 e: b+ d2 _+ L
2017 年国自然申请的热点什么？circRNA，lncRNA，外泌体。除了这些大家耳熟能详的香馍馍之外，现在很多小伙伴们开始了新的玩法，通过多平台联用，将不同层面的东西结合起来，比如，表观遗传与非编码 RNA 的结合，就是一个很好的例证。
4 W: E) m2 F; M1 y, {/ o' e研究背景0 G8 i" t2 C. T+ l7 |7 s
肺癌是一种常见的恶性肿瘤，特别在中国，由于环境的污染，肺癌的发生率也在持续升高。非小细胞肺癌（NSCLC）是肺癌中最常见的一种，大约占了肺癌总量的 85%，但是，目前我们对于 NSCLC 的理解还是处于初级阶段。其中，表观遗传学和转录组学的研究为我们理解肿瘤的发生提供了很多的证据。那么，这两个层面的分子又存在什么样的关联呢？本研究从甲基化，lncRNA 和基因表达调控的角度出发，为我们理解 NSCLC 的发生和临床诊断提供了新的靶标。* h9 h% d7 h: [( _1 s  H
研究思路
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研究结果
; }; X! L1 X, a0 L1 z' I* P1． 鉴定 NSCLC 特异性 lncRNA-mRNA
) T! T7 \% q6 G9 c/ oNSCLC 在转录组层面，有哪些特异性表达的分子呢？利用转录组表达谱芯片（SBC human lncRNA array 伯豪生物提供），研究人员发现有 8500 个 lncRNA 和 1685 个 mRNA 在癌和癌旁中有显著差异。通过对这些差异基因分析相关性，发现有 1345 个 lncRNA 与 mRNA 存在 cis 关系，159 个 lncRNA 与 mRNA 有 trans 关系。把这些与 lncRNA 关联的 cis mRNA 进行 IPA 功能（IPA 分析，详情咨询 shbio）分析发现，主要的 pathway 涉及到肿瘤相关，包括细胞死亡与生存，细胞发育，细胞生长和增殖，表明这些关联的 lncRNA 可能参与肿瘤发生过程。研究人员把其中的两个 lncRNA 与 mRNA(LOC146880/KPNA2，ENST00000439577/RCC2) 作为后期验证的重点。  Z* L( i* F1 A) l
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2. lncRNA 与甲基化关联分析
# O7 [( j- p- f+ k% h除了转录组层面的变化，表观遗传层面会有什么差异呢？利用甲基化芯片，研究人员发现癌和癌旁共有 113644 个差异 CpG 位点。其中，cg12562461 位点正好位于 LOC146880 的启动子区，且在癌组织中甲基化程度低。因此，cg12562461 的低甲基化正好与 LOC146880 的高表达相对应。
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; ?; O! ^# U# s! F- T0 \/ b( a( a3.lncRNA/mRNA 与临床指标关联性分析/ z8 T2 l( |/ E, W: F& A% R1 P
通过 qPCR，研究人员首先在大量样本中（402 个癌组织，105 个癌旁组织）进行了验证，发现 LOC146880 和 KPNA2 在癌中高表达，且两者表达显著相关。进一步分析 LOC146880 和 ENST00000439577 与病人临床指标，发现 LOC146880 与病理类型和肿瘤大小有关，ENST00000439577 的表达与转移状态和疾病 stage 有关。Kaplan-Meier 生存曲线分析显示，training 组和 validation 组中，高的 LOC146880 伴随着低的总生存期。同时，在 126 个癌组织和 30 个癌旁中，cg12562461 的甲基化程度也明显低于癌旁。同样，ENST00000439577 和 RCC2 的表达也是在癌组织中高，两者表达正相关。高的 ENST00000439577 表达也与低总生存期相关。因此，这两个 lncRNA 可以作为潜在的诊断指标。
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8 V. l9 x% u% I4.lncRNA 细胞系功能验证
3 x9 V+ W5 B& e; \+ @& e为验证在肺癌中 LOC146880 的生物学功能，研究人员分别检测了三个 NSCLC 细胞系（A549，PC9，H1299）和正常细胞系，发现 LOC146880 在 A549 和 PC9 中表达高。当在这两个细胞系中 siRNA- LOC146880 敲降，发现 KPNA2 的表达也随之降低。此外，细胞增殖，迁移和侵袭受到抑制，细胞周期过程减慢了 G2/M phase。因此，这些结果都表明 LOC146880 可能是 NSCLC 的致癌因子。4 n$ |- X; p" b$ v5 z  A
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基于 TRANSFAC 预测，研究人员发现 LOC146880 的 CpG 位点区有转录因子 SP1 的结合位点。当将 LOC146880 的启动子区载体构建（pGL3- LOC146880），和 SP1 过表达载体同时转染 HEK293T，A549，H1299 时，发现 pGL3- LOC146880 显著激活。因此，SP1 确实能结合到 LOC146880 启动子区，通过转录调控影响其表达。
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在 NSCLC 三个细胞系（A549，H1975，H1299）和正常细胞系检测 ENST00000439577 表达，发现比正常细胞系中都高。当在 A549，H1299 中 siRNA 干扰后，RCC2 表达也降低，细胞增殖，迁移和侵袭也降低，细胞在 G2/M phase 稍微降低。因此，ENST00000439577 可能也是肺癌的一个致癌因子。, v' N& ]$ C* \4 v

. s! X! F7 D2 u' ^( b/ W0 y' s研究结论* y6 @. b$ c9 m. G# z$ X( s" T
该研究通过将表达谱芯片与甲基化芯片结果进行关联分析，找到了启动子区甲基化降低，同时基因表达升高的 lncRNA，并发现他们的表达与 cis 靶基因 KPNA2 和 RCC2 的表达正相关，并与低生存期相关。细胞系的 siRNA 干扰，功能实验验证表明，这两个 lncRNA 抑制了细胞增殖，侵袭和转移。该研究同时将表观遗传和转录关联起来，从更全面的角度去理解了 lncRNA 在非小细胞肺癌中的作用。这种平台联用的方式是该研究的亮点，也是现在最新的流行趋势，非常值得借鉴。
: }0 z' y+ P& Q8 {0 J+ {原文出处：Feng N, Ching T, Wang Y，et al. Analysis of Microarray Data on Gene Expression and Methylation to Identify Long Non-coding RNAsin Non-small Cell Lung Cancer. Sci Rep.2016.
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