清华谭旭研究组《Cell Research》：体内靶向治疗的新型非病毒 CRISPR/Cas9 系统

yinfuhua

清华谭旭研究组《Cell Research》：体内靶向治疗的新型非病毒 CRISPR/Cas9 系统8 C3 S9 C# _+ `4 P( Y2 G; E& S# b
来源:清华大学药学院 / 作者: / 2017-01-25
  h! @, e2 g  m4 m! y: I; `4 }2017 年 1 月 24 日， 清华大学谭旭研究组 与美国俄亥俄州立大学董一洲研究组合作在《Cell Research》上发表了题为《A non-viral CRISPR/Cas9 delivery system for therapeutic gene targeting in vivo》，在国际上首先研发出 一种新型 CRISPR/Cas9 递送系统 ，其能够在体内递送 CRISPR/Cas9 至肝脏， 并在单链引导 RNA（sgRNA) 的引导下靶向切割外源或内源致病基因从而达到治疗肝病的目的 。该种新型递送系统为 CRISPR/Cas9 这一强有力的基因编辑工具，在临床上的实际应用开辟了新途径。# {# O# O' q$ q" C: A: Y+ y
自上个世纪 90 年代以来，基因治疗逐渐兴起，其通过补偿基因缺陷或修正异常致病基因从而达到治疗的目的。CRISPR/Cas9 是在细菌中发现的一种 DNA 剪编辑系统，由于其高效特异的 DNA 剪切和编辑能力在科研领域已经得到广泛应用，而在临床治疗中其应用前景也非常值得期待。已有的 CRISPR/Cas9 体内输送是通过运用腺病毒表达体系来表达 Cas9 和 guide RNA，如同腺病毒在基因治疗历史中的巨大作用一样，但也存在诸如腺病毒缺乏靶向性，本身免疫源性较高，病毒在体内有一定重组突变机率等问题。而且，腺病毒在细胞内的长期稳定表达 Cas9 DNA 酶，也有可能带来长期的毒副作用。
% |5 y$ V5 z; C6 a) E5 t$ j% D5 Z基于脂质纳米颗粒的核酸输送系统已经在活体内输送小 RNA，如 siRNA 上表现出良好的效果。谭旭课题组与董一洲研究组合作研发了一种新型脂质纳米颗粒系统，其可以包裹 Cas9 蛋白的 mRNA 以及单链引导 RNA 并在活体内有效的输送至肝脏并进行表达, 对特定致病基因进行切割。
+ e  N% K" f! f为测试所研发的新型脂质纳米颗粒系统的实际效果，研究组分别选取了以下一个外源性靶点和一个内源性靶点进行测试。选择的外源性靶点是乙肝病毒（HBV）基因组。全球乙肝病毒感染者约有 3.5 亿人，而在中国更是一个严重的社会问题。乙肝病毒难以彻底清除的主要原因是其基因组以一种共价闭环 DNA（covalently closed circular DNA 或 cccDNA) 形式存在，而现有治疗手段均无法触及 cccDNA；选择的内源性靶点是前蛋白转化酶枯草溶菌素 9（Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9, PCSK9）是当前针对高胆固醇血症和其它心血管疾病药物研发的重要靶点。就目前来看，针对 PCSK9 的药物主要是抗体类药物，需要长期多次服用，价格昂贵。上述二者均有希望通过编辑其基因序列而达到治疗的目的，故研究组选取此二者为对象，测试这种新型的药物递送系统。, R; ]  q" x4 [  _/ z5 C+ h
研究发现在细胞水平上，经这种新型脂质纳米颗粒（LNP）包裹的 Cas9/sgRNA，能够有效的对细胞中 HBV cccDNA 和 Pcsk9 基因进行切割，并有效的降低 HBV 相关抗原的表达。动物实验结果表明，这种新型脂质纳米颗粒可以有效递送 Cas9/sgRNA 输送至肝脏进行表达，并且尾静脉注射 6 小时后 Cas9 蛋白表达量达到最大，其后逐步降低，24 小时后消失。在肝脏内，所递送的 Cas9/sgRNA 能对内外源基因序列进行有效的特异性剪切，进而降低相关蛋白的表达量。一次注射能有效降低乙肝病毒表达量 50% 以上。国际审稿人认为这项工作是本领域激动人心的成果，对 CRISPR/Cas9 系统未来的临床转化研究有重要意义。该研究成果以通讯形式于 2017 年 1 月 24 日在线发表于《Cell Research》上。- X$ b; n( W. ~4 s1 g, E$ J  {
论文通讯作者为谭旭和董一洲。清华大学生命科学学院博士生蒋超、梅淼，俄亥俄州大学博士后李斌、清华大学医学院博士生朱修锐为共同第一作者。清华大学生物医学工程系的郭永课题组也有重要贡献。该工作得到了科技部重点研发计划，中组部青年千人计划，生命科学联合中心和美国盖茨基金会的资助。3 Z: @0 O3 b, m2 B8 {+ r
  ?/ g- k' b. B$ B/ X8 q2 H- E7 L
图示：纳米脂质颗粒能有效的把 Cas9 mRNA 和针对乙肝病毒 DNA 的引导 RNA 输送到动物的肝细胞内。Cas mRNA 随后被翻译成 Cas9 蛋白，蛋白与引导 RNA 结合后特异性的识别乙肝病毒 DNA 并对其进行剪切，导致病毒 DNA 突变或者降解，从而从源头上降低病毒的水平。) q. q3 i7 s  Q) m# `) E
原文：A non-viral CRISPR/Cas9 delivery system for therapeutic gene targeting in vivo2 Y. F( Q- }& {/ B