细胞复苏传代后死亡

时一清

HEK293T压出的稳定细胞系，复苏时形态正常，细胞长得也比较快，传代后观察大量细胞不贴壁，贴壁的细胞也会渐渐死亡。
, |8 s" R5 P9 R复苏过不同批次的3管均出现这种情况，培养基：10%FBS（PAN）+DMEM  e* Q% T+ L$ z. _
后来改了培养基，20%FBS+1%p.s+DMEM，细胞渐渐好起来了。( `8 k' \! \5 w/ r) y: U
本学期初，复苏，又出现了传代即渐渐死亡的情况。
; q0 {0 ]) ?6 R2 _$ m请教大家？

追风筝的July

冻存的细胞会不会质量不太好，亦或是细胞中间存在污染？正常来所贴壁的肿瘤细胞比较好养的。

时一清

谢谢。晚上又观察了下细胞，大部分还是贴壁的，部分细胞瘦长，没有棱角。

lchanlon

Freezing cells without DMSO?????

lchanlon

For HEK293T, the more FBS you use, the better stock you get. Suggest you use 10% DMSO + 90% FBS. Works very well.

田甜

1.排除一下有没有污染。4 w7 F) `# O; c; z
2.复苏使用的培养基尽量与冻存前使用的培养基一致。
+ y2 Q8 N2 {( Q' x5 ?3.传代后出现细胞死亡，建议提前一天传代，避免细胞太满。

田甜

复苏应该继续使用20%FBS的培养基，但可以高密度接种，尽早传代，传代后慢慢降低血清至正常浓度。这种方法应该能慢慢改变细胞状态。

时一清

回复 lchanlon 的帖子
0 G4 u" `  h$ x4 l6 L, ~) R3 @* b& ?2 M$ `/ E, o
yes, I use 10%DMSO+90%FBS to freeze cells

zhu1019

在消化细胞前要把冻存液先配好，放4度预冷，因为DMSO常温下对细胞毒性较大。然后收集细胞，计数，PBS洗后再用预冷的冻存液重悬（在这之前把冻存管准备好，标签写好），加入冻存管，封口后立即放入程序降温盒，然后转入-80度冰箱，过夜后转入液氮罐长期保存。复苏最好也用预冷的PBS或生理盐水洗。