上海生科院在 Cpf1 蛋白切割机理方面取得新进展

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来源:上海生命科学研究院 / 作者: / 2017-02-222 |0 r/ V* n, p) [( L: k
专题聚焦： 基因编辑的“中国元年”9 |* U/ D* P9 @; \  p. [4 n
大牛聚首： 3月24日上海-基因编辑学术研讨会
) K+ g5 U  O1 F1 N6 B3 N1 月 11 日，国际学术期刊《核酸研究》（Nucleic Acids Research）在线发表了中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所赵国屏研究组题为 The CCTL (Cpf1-assisted Cutting and Taq DNA ligase-assisted Ligation) method for efficient editing of large DNA constructs in vitro 的研究论文。该工作鉴定了 Cpf1 蛋白的精确切割位点，并基于该切割特性开发新的 DNA 无缝拼接方法。) K8 p: B; |: y: ?$ v
CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是存在于原核生物中的获得性免疫系统，CRISPR 相关蛋白 Cas9 已广泛应用于基因组编辑和许多其他应用当中。Cpf1 蛋白隶属于 II 类 type V CRISPR 系统。相比于 Cas9 蛋白，Cpf1 蛋白具有类似的基因组编辑效率，但具有较低的脱靶效应，在基因治疗应用中具有巨大的潜力。不同于 Cas9，Cpf1 由单个 crRNA 指导，并利用富含 T 的 protospacer 相邻基序（PAM）序列切割双链 DNA（dsDNA）靶标，形成 5-nt 粘性末端。Cpf1 的切割特性使得其成为有效的体外 DNA 拼接工具，并且最近的研究中报道了基于 Cpf1 消化和 T4DNA 连接酶介导的连接建立的 DNA 拼接标准 C-Brick。0 u3 w7 d( A3 t4 p- j0 u
在该研究中，研究人员发现，Cpf1 切割靶标 DNA 并不像之前报道的那样，只切割靶标 DNA 互补链的 23 位和非互补链的 18 位，而是在非互补链的 14 位到 18 位形成多个切割位点。除此之外，该文研究人员还发现 Cpf1 的切割位点受到 crRNA spacer 序列长度的影响。当 spacer 序列长度大于等于 20 的时候，Cpf1 倾向于切割非互补链的 18 位，而当 spacer 序列长度小于 20 的时候，Cpf1 倾向于切割非互补链的 14 位。基于 Cpf1 在较短 spacer 长度的 crRNA 介导下，可以特异切割靶标 DNA 的 14 位与 22 位，形成 8－nt 的长黏性末端的特性，结合 Taq DNA 连接酶高精度的连接特性，研究人员将其开发为一个大 DNA 片段体外无缝编辑的新工具。在应用实例中，研究人员成功将 30kb 的放线紫红素合成基因簇内部调控基因 actII-orf4 的启动子进行了原位的替换。经过反应条件的优化，替换的阳性率达到 70% 以上。该方法为大片段体外编辑提供了一个高效工具。
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