换液或者传代到第二天的时候培养液出现很多杂质

fenglinzhu

同时培养了不同批次，不同种类的几瓶细胞。都出现一个同样的问题，换液或者传代后到第二天观察会有很多漂浮的杂质。大神们有没有碰到过这样的情况？
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9 L6 P3 C: C) |# H2 `注：1、培养基未出现明显的混浊、变色现象。0 x2 O& U& V- D/ G- P  A1 Z
       2、其中有一种细胞用未加双抗的培养基培养后污染了，加双抗的没出现明显的污染，只是有很多杂质。' N' t/ o! z; i: R
       3、所有试剂都用0.22um滤器过滤并做无菌检测合格。
$ u/ a" @% e# Y! E1 `9 T1 J       4、为了避免操作引起的问题，每个批次每种细胞都有4个人同时同条件培养，均出现上述问题。
" e& i* ?7 i; A/ t       5、不管细胞状态好坏都存在上述问题。7 O9 U8 N  h0 N3 L7 z

rzghc

支原体检没检过

cxs

回复 fenglinzhu 的帖子% r0 o3 l8 I2 G

$ h" M4 A3 R5 X- m6 w0 I4 `有些问题没描述清楚，不好判断：) Z  I: X- o' H- n) T4 G
1、你指的“很多杂质”是什么样的，能否描述一下。是不是黑点？均质与否？（就是说大小是不是差不多）仔细观察一下有没有布朗运动？" g- ?! T7 n7 h* s$ V0 l5 o
2、换不同批次的细胞这个没啥问题，培养基是否换过？特别是血清。
" [/ {. F+ y2 P1 L4 Z3、是否确保细胞不是冻存出了问题。如-80冰箱停过电，或液氮为及时补充，导致即使不同批次也有可能状态一样都不好。$ ^3 t$ n+ ~- c+ F# M8 x! y6 N
4、默认为排除你操作问题了，比如消化过度这类的$ O: U& R- T8 u% B  s* ~; l( B0 M0 T
5、另外，支原体个人认为没必要去检，首先，普通光学显微镜是看不到，其次，如果支原体都对你们细胞产生这么大影响，你们实验室基本就废了。待过几个实验室，没一个实验室送检支原体的结果是干净的，只要不影响细胞状态，实验该做做，paper该发发。没了解过国外，在此也想请教一下国外待过的朋友，国外如何对待支原体污染这一块的问题

fenglinzhu

回复 cxs 的帖子% w# u# p6 ]) f" q& @" x6 W: o

" c# K: K0 U8 ?$ k有许多小黑点，大部分是均质的，个别有丝状物。由于老板比较抠，血清和培养基都没换，但是每次使用前都会过滤。冻存问题肯定有，但是就算是状态好的细胞里面也会有很多杂质，而且都是隔天后才出现的。另外，用没加双抗的培养基培养的话基本2-3天就严重污染，加双抗的培养基培养就出现很多小黑点，可以洗掉，但隔天又会有。消化的话基本看到细胞开始变圆脱落就终止消化。

阿秀哥

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小黑点？会不会是黑胶虫污染了

liuyunmeng2002

可能是污染了，可以培养培养做做鉴定，试剂也做做微生物培养试试，如是不同批次，不同种类，不同人，只可能从大环境，统一的影响因素去分析，共用的共有的一些因素，如实验室环境，培养基，血清，或操作环境，是否共用的冻存空间等等查查原因。

gondobar

你说的情况很有可能是污染了，不加双抗两天就污染说明污染以及很严重了。

cxs

回复 fenglinzhu 的帖子2 S. U0 i$ X! ?; |* B6 t9 l4 K
  R! q  f% _$ u# N4 ^
根据你的描述及自己的经验，我做出如下判断：
% s* K4 l- t4 z- R! [1、曾经出现过这个问题是因为用了国产血清，可能是细胞营养供应不上，细胞比较脏，出现黑点（不会动），判断是死细胞碎片，并不是污染，换个血清就解决了，据我所知，GIBCO的血清也分等级的。; h+ p& a7 B" J9 M* ~+ b
2、出现过几次用进口血清也出现黑点，但是会动，轻度情况下不是很影响细胞生长，重度情况下，无需镜下看也能看到白色细沙状，培养基颜色无变化。可能就是另一位朋友所说的“黑胶虫”，咨询过一个经验丰富的老师，他不认为有黑胶虫这种东西，认为就是未知名原生生物污染。处理结果只能丢弃，再把实验室好好整整。, T8 ~$ G$ U& f+ I! C: f( R; H

2 l: z4 f* D9 }5 _- h综合以上，建议如下方法排除：
' \$ A5 F% K5 D5 Q设置两个变量——细胞（你自己的和别人养着的没问题的）+培养基（你的培养基和别人用着的没问题的）。如果自己实验室凑不齐以上条件，建议找别的实验室要点。以上两两组合就是4个平行组。如果4组均出现小黑点问题，建议再增加一个变量——培养环境（你们的培养箱和别人用着的没问题的培养箱），当然这是可能性较小的，所以分在附加项。
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# s1 D* t5 O0 T) i. Z& L以上是我能想到的最完善的方案，想的不充分，可能可以精简，或者还需要增加。抛砖引玉，集思广益。祝好

cxs

回复 fenglinzhu 的帖子0 l5 E; O0 c' J) B7 K
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另外，建议上图片会比较直观点哦，这样帮助解答的大家也不至于无的放矢