养人胚胎干细胞H9出现状况

吃呆猫

请教下，我养h9用的stem cell的E8，matrigel 1:30铺板，传代加Y27634。用EDTA消化，但每次传代细胞特别难刮下来，死的还特别多，而且到了D3，D4还会飘起来（这是关键，每次养着养着就没了），是怎么回事？

wangxiang

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/ A  H, _1 I/ H: h
一般加室温放置的EDTA，然后放在培养箱中3-5分钟，可以看到边缘卷曲，中间分散的情况，这种情况吹4-6枪就可以收集到细胞了吧？直接刮对细胞状态有影响的。可能就导致了细胞分化，E8体系只能维持干细胞的培养，分化了的细胞就直接不行了。另外，你们太土豪啦，这基质胶的浓度太高了。。。

siyubai1008

你可以用一下胶原酶

上官轩伦

回复 wangxiang 的帖子- s8 z2 N0 M4 m! J2 V6 `, T
, T/ G% s, x  ~2 u, @4 i
就是感觉消化5分钟，细胞团并不能很好的分离下来，想问一下有什么好方法吗，还是就是增加消化时间？7 S, X1 L, Z) h; ?+ }
另就是在这个传代过程用什么好方法把细胞团打的相对散一些且不尽量伤害细胞吗？) a$ f9 h9 j1 y6 a( Q% o
谢谢

huohaiqin

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+ B0 W9 `/ f. {我们使用的是vitronectin，比matrigel要好消化一些

上官轩伦

回复 huohaiqin 的帖子; x0 P: K1 p/ q* ^

  ^! }. E- ^5 P* S6 v$ P我们也是用的vitronectin，想问一下您的稀释比是多少

huohaiqin

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Life的，10ul到1ml体系里，常温包被1小时。

Sunflower.wang

传代不加Y27634，matrigel 1:100