盖兰德选育成功世界首例病毒安全近交系小型猪新品系

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      盖兰德生物科技公司联合军事医学科学院章金刚、马玉媛研究团队，成功选育出世界首例无猪内源性反转录病毒传染性的近交系小型猪新品系。该研究成果在2017年6月23日第八届北京实验动物科学国际论坛上以研究报告形式正式发布。此项成果，标志着盖兰德生物科技所独有的小型猪近交系种群获得安全性品系的重大突破，是公司开发近交系医学领域应用的一个关键里程碑。6 d" P$ t6 S1 \: W% m
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      猪是异种器官移植的最佳供体。而用于人的猪源异种器官移植两大障碍之一，是猪内源性反转录病毒（porcine endogenous retrovirus, PERV）的潜在感染风险。PERV是一种以前病毒DNA形式整合入猪基因组中的反转录病毒，由PERV-gag、pol、env三基因组成，可随细胞基因组的复制而复制。部分猪源细胞可释放PERV病毒颗粒，并能感染多种体外培养的人源细胞。因此，消除PERV的潜在跨物种感染风险，是异种器官移植的必要安全考虑。; I4 c1 C4 r9 `: x

6 Y: ]; M- Y; C　解决PERV风险的途径有两种。一种是通过基因修饰技术去除猪体内PERV基因。代表成果是哈佛医学院遗传学教授乔治·丘奇和杨璐菡博士团队，利用新的基因编辑技术CRISPR/Cas9，一次性的敲除了隐藏在猪基因组中的62个PERV-pol基因片段，体外实验验证病毒的感染率被削弱了近1000倍，结果发表在2015年10月《Science》杂志。同年，该团队联合创立了美国eGenesis生物技术公司，专注于将基于基因编辑的异种移植技术运用到临床医疗程序中。近日有报道称，eGenesis公司经过多基因修饰的PERV阴性猪即将出生。与此同时，我国多家科研团队也在尝试采用基因编辑方法培育PERV阴性猪，并先后取得各种阶段性进展。" l" T# x& c% k: h6 j  \

: w" Q0 M, b5 z0 z- H; S. n6 B　排除PERV病毒潜在传染风险的另一种途径，则是选育无PERV传染风险的猪。盖兰德生物科技公司首席科学家、我国自主知识产权的五指山近交系发明人冯书堂教授，与军事医学科学院章金刚、马玉媛研究团队在PERV研究上有长期合作，共同研究中发现近交系的PERV病毒较弱的特点。依据近交系进化规律的推测，提出了在近交系中筛选PERV病毒阴性猪的概念。在对五指山小型猪近交系PERV病毒多年跟踪研究的扎实基础上，另辟蹊径，在世界上首次采用遗传筛选的方法，经过细胞共培养，采用PCR、RT-PCR、反转录酶活性检测等方法进行鉴定，通过初筛与确证实验，参照美国FDA的标准，在五指山小型猪近交系中筛选出无PERV传染性的近交系小型猪个体。经初步遗传分析，所有筛选出的无PERV传染性个体之间存在一定的遗传规律。在这一重大发现基础上，研究人员正在对筛选出的无PERV传染性个体进行全基因组重测序分析，现已证实其中1个个体为PERV-pol基因缺陷型。至此，研究团队不仅第一次在国际上筛选出了无PERV传染性近交系猪，而且从基因水平上验证了无PERV病毒传染性的原理。上述研究成果已申请国家发明专利两项，并即将在国际期刊杂志上发表论文。 / U0 m7 B' a7 f* }( @
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  　研究团队认为，无PERV传染性的小型猪近交系的选育成功，主要原因是五指山小型猪近交系经过长达28年的近交培育，已普遍具有PERV病毒A、B型弱、拷贝数少、无C型病毒的遗传特征，近交种群演化进程中出现病毒传染性发生变异的个体。盖兰德生物科技有限公司在此基础上，利用筛选出的父母均为无PERV传染性近交系猪进行近交繁育，F1代猪已于2017年5月底出生。研究团队将持续对其进行无PERV 传染性的监测，未来有望进一步揭示PERV病毒pol基因缺陷型猪的遗传原理，并为大规模异种器官与材料制备打下安全种群基础。  A3 W, B5 m; X! |# e7 i" `

' N, e( V4 J) G# B$ x1 z   　相比较基因敲除制造无病毒猪的方法，近交系筛选无病毒感染猪具有多种优势。首先，PERV病毒拷贝数仍不确定，基因编辑方法彻底敲除多基因拷贝具有一定难度，且用于大规模快速生产基因敲除猪，存在效率与效益问题。而近交系筛选无感染性种群的方法，具有更可靠的病毒安全性，可避免多种基因修饰对猪健康生长的潜在威胁，更重要的是可以利用近交系耐近交的优势，通过无传染性猪的大规模繁育，形成种群，为批量生产安全标准的猪器官、组织与材料提供保障。1 ]) j: ~6 u: x2 F0 q
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  　无PERV传染性近交系猪新品系的获得，可从感染性上彻底消除猪源医用生物材料应用于人体的潜在人畜共患病毒风险，具有重大的社会意义和经济价值。利用无PERV传染性近交系猪作为供体来源，可解决猪源胰岛细胞、脑神经细胞、角膜组织、心脏、肝脏、肾脏等等异种移植的病毒感染后顾之忧，加快临床研究的进程，某种意义上为猪源材料的临床应用提供了一种可靠的技术标准。无PERV感染性近交系的选育成果，将会大大加快异种移植临床植入产品与材料的开发，为临床实验提供安全性保障，并有望促进异种植入材料与器官的监管规则的建立。( e+ S2 h! b9 o+ @9 |9 h% A6 a
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  　目前，盖兰德生物科技公司及其合作伙伴正在开展无PERV传染性的猪源角膜内皮细胞移植生物安全检测和评价，计划2018年下半年开展无PERV传染性猪源角膜内皮细胞移植临床研究，以期解决和满足市场对角膜供体的重大需求，帮助更多的角膜内皮病变致盲患者恢复光明。南京医科大学戴一凡教授担任项目负责人的2017年度科技部“生物医用材料研发与组织器官修复替代”重点专项中“基因修饰的巴马小型猪和近交系五指山小型猪作为异种器官供体”项目也将利用无PERV传染性近交系小型猪开展人源化基因修饰，为猪源胰岛、心脏、肝脏、肾脏等异种器官移植提供高生物安全性、低免疫原性的人源化猪供体。这一研究成果在日前西安第四军医大学召开的“第三届全国异种移植高峰论坛”期间，引起了与会代表的很大兴趣，并有研究团队提出进一步合作。
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  　随着无PERV传染性近交系猪研究成果的推广，预期将会带动更多国内外科研机构和生物医药企业参与到该成果生物医药产品应用的研发与生产，大大推动异种器官移植、猪源临床植入材料以及相关生物工程产业的发展。
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