关于胚胎干细胞的培养液更换

tiangao

初次养胚胎干细胞。滋养层用射线失活，复苏了胚胎干细胞。复苏后看看细胞状态都还不错。因为有关文献说复苏三天内不要换液，可我害怕培养基的PH值下降，在复苏后的（复苏算0天）第二天加入了一部分培养液。第三天是周日，没去实验室，结果周一过去一看，天！所有的细胞都飘起来了！！！！是因为培养液过酸吗？唉！还有，文献上bFGF是用BSA+含钙镁的PBS稀释的，可我买的bFGF说明书上说要用Tris-HCL稀释，想了一下，还是决定用Tris-HCL 稀释，想来应该不是这个问题吧，因为这个对MEF影响不大啊！郁闷中！望专家指教！万分感谢！
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tiangao

ES大概是死掉了吧。
( R5 d, P; @6 `  t0 `+ \5 @+ l3 G首先，第二天加培养液是不会有问题的。; j; F  X6 B8 n$ S
你用的培养基是加过酚红的吗？颜色变黄了吗？只要不超过橙色就不是过酸。
4 @3 i2 X9 ^4 C$ o; z有复苏后第二天的照片吗？

tiangao

我认为你复苏后三天内最好不要换液或者部分换液，三天内一般不会培养液的营养成分全消耗的，你细胞接种的密度要适当，你这样的操作很可能在换液的时候很容易把细胞吹起来会影响其状态的，而且貌似细胞培养用到的PBS一般都是无钙镁的

tiangao

第一个问题可能原因如下：
9 o+ ?) n( F; T" ^9 Y1.  ES培养液是否与以前的一样，若该ES以前用FBS培养，现在你用SR可能也会出现这种情况) t$ \& ^2 M0 T! n
2.  饲养层状态不好- u. o$ h  [2 v0 n! A" c3 A
3.  ES种植密度可能太大, ^7 P5 p) l8 T# c( _+ G" X6 ^
4.  换液时间没掌握好，ES贴壁后（大约复苏次日）就可以半量换液了。6 \) @' I# a: o8 I, `
5.  换液前最好在培养箱中事先平衡一下培养液% G9 |( a% W9 o
第二个问题：
, y  T: c5 X5 r; ?. S% v& `bFGF可以用含钙镁的PBS稀释，也可以用ES培养液（不加因子的）稀释

tiangao

赞同楼上的意见。就我培养小鼠ES的经验，我认为：与冻存时ES的状态有很大关系，如果冻存时ES的状态就不是太好，那复苏的时候复苏效果会差很多。这个时候我通常都是在复苏后天天全换液，确保有足够的营养成分支持它生长，且去除死细胞对活细胞的影响。只要有一个ES存活，那在几天内肯定能形成克隆，再传多两代细胞就会好转。在养ES的时候一定要控制接种密度，否则对ES的生长也会造成较大的影响。这个多做几次就会有心得的。Feeder的密度也不易过密，过密反倒不利于ES的生长。

tiangao

建议在复苏后第一天进行半量换液！

tiangao

我想请教下，ES的接种密度大概是什么数量级的呀？谢谢！

tiangao

小鼠的ES细胞比人的好养多了，一般复苏过夜后直接全部换液，3-4天完全可以长起来。再延长时间也不会增加细胞的贴壁，凋亡细胞反而会影响到贴壁细胞的生长！当然，建系的话另当别论，一般是48小时后换。如果反复几次细胞都贴壁不好的话就应该考虑是细胞冻存时的状态了，可以试着在复苏当天加Rock Inhibitor。

tiangao

约2-3×105/每孔（six-well)就差不多了！

tiangao

我还想请教下，你们一般是酶解法还是机械法传代呢，能不能给我一个详细的步骤呀？非常感谢！还是新手，请多多关照！