请教：ips实验中如何避免转染后成纤维细胞生长过速的情况？

亿云

我是这个论坛的新人，也是前几个月刚刚开始ips的课题。目前正在做牛的ips，在病毒转染成纤维细胞之后使用人的ES细胞培养液（DMEM/F12加20%的KOserum）在有MEF和无MEF的盘中分别培养。六孔板中每个孔（9.5 cm2)的细胞数量是30000个（个人认为这个密度并不是很高）。转染后三天通过免疫荧光染色oct4证明转染成功。0 y- m  A0 \1 n. k
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当培养到第7~8天时，孔内的细胞已经完全覆盖了整个板子，之前观察到的一些有ips迹象的细胞也被新长出的成纤维细胞覆盖。这样一来不但阻碍了所有细胞充分接触培养液，也容易造成细胞脱离翻卷的现象。
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我个人觉得人类培养液中的FGF可能对牛的成纤维细胞的生长有极强烈的刺激作用，可是FGF又是培养干细胞的重要信号物质，所以不知道用什么方法才能避免成纤维细胞生长过速的问题。
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希望得到论坛内相关指点。多谢！9 d- i3 u' b- M# A
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本文及回复 转贴自干细胞论坛

亿云

你的MEF事先没有用MMC处理过吗？我的经验是往往不够mEF到后面还要补两次mef，不知道其他人的结果怎样啊

亿云

我此处说的MEF是mitomycine处理过的。
# }5 x. v7 r/ b+ V我很好奇2楼所指的MEF不够用的意思。

亿云

不好意思 看错了 你往铺了mef的皿上种成纤维细胞时的密度是多少啊 一般密度是10的四次方到五次方之间 我做的这个密度还可以 不会长得特别密 而且还有克隆出来

亿云

我在原帖中提到过“六孔板中每个孔（9.5 cm2)的细胞数量是30000个”，那么看来和楼上所属情形大致相同。不过可否请教楼上，您的情况下，ips细胞团大致在什么时间形成？（即分割的时间）

亿云

六孔板是用于感染用的，然后还有把细胞消化下来，种到10cm盘上面，盘要先铺feeder（MEF）。每盘大约铺10000

亿云

当然也会根据生物种类以及细胞类型的不同，种的密度不同

亿云

大概第四周可以分了

亿云

不知道楼主是不是会在感染细胞几天之后split一下（1：3~1：6），保证细胞不会太密；我做鼠的也是六孔板里种30000个，一般在感染之后第三天1：3传代，这是yamanaka的流程。, C, ~! m- \# c( [1 }/ g4 B, O
另外楼主有没有尝试过用小鼠ES的培养液来诱导，不用人的