科研专题之CAR-T治疗肿瘤的新方向（一）

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肿瘤免疫逃逸：- b$ f( \" x; V# F
大量研究表明细胞毒性T淋巴细胞（CTL）在机体抗肿瘤免疫应答中处于主要地位，对肿瘤细胞具有较强的杀伤作用。由于肿瘤免疫编辑作用，下调MHC在肿瘤细胞表面的表达，破坏抗原的加工过程，降低免疫活性。CTL对肿瘤免疫应答刺激信号的产生主要依赖于MHC-抗原肽-TCR复合体的形成（图1，生物谷），因为肿瘤细胞的免疫编辑，以及对靶抗原处理能力的下调，降低肿瘤细胞抗原递呈水平，使T细胞很难识别肿瘤细胞，导致肿瘤细胞逃避机体免疫监视，促使肿瘤发生发展[1]。有学者通过基因工程增加肿瘤细胞MHC表达水平，然而肿瘤内MHC mRNA表达水平增加，但细胞表面MHC分子并未发生改变，这可能涉及内源性抗原加工及呈递过程。
5 T- s8 ?/ w% ?/ K% V3 `, |; K       早期的过继免疫疗法对患者症状的缓解以及生存质量的提升具有一定指导意义。肿瘤浸润淋巴细胞疗法（tumor infiltratinglymphocyte）已经在治疗恶性黑色素瘤方面取得巨大成效，但TIL的获取以及培养、生产均有一定的难度，且患者对单个抗原的免疫耐受和主要组织相容性复合体（majorhistocompatibility complex， MHC）限制了此方法的应用[2]；此外，DC-CIK治疗也同样遇到这样问题，由于MHC的限制以及肿瘤细胞微环境的影响，以致收效甚微，干扰了免疫疗法的应用以及推广。
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3 X2 m8 U/ \" Y. J7 H: }' XFig.1 Tumor cell immune escape by MHC( m$ g1 r2 Z& h4 ?8 A9 D" ~
CAR T细胞治疗原理：
/ }/ v3 Z, Q& k  K! E& N. D2 i      CAR-T（T细胞嵌合抗原受体）作为一种新的免疫细胞治疗方案，在一定程度上克服了上述的不足。CART细胞是指T细胞经过遗传学修饰进而表达嵌合的抗原受体，一旦T细胞表达这种融合受体，便可使T细胞与抗原进行特异性结合并激活T细胞。CAR由四个信号区组成：胞外单链多变靶向锚定域（scFv）、一个铰链区，一个跨膜域和一个胞内信号激活域（图2，Jessica Hartmann，etal. 2017）[3]。比较于T细胞受体（TCR）修饰的细胞，CAR-T细胞具有HLA非依赖方式识别细胞表面抗原，通过胞内信号域免疫受体酪氨酸活化序列（immunoreceptor tyrosine-based activation motifs）信号传导，诱导抗原T细胞活性，增殖以及产生细胞因子，进而杀伤肿瘤[4]。由于CARs能够以非MHC方式识别广泛肿瘤抗原，使经CAR改造后的T细胞能够跨越HLA肿瘤识别机制，克服病人HLA抗原分型的限制[1]，而目标抗原的选择对于CAR的特异性、有效性以及基因改造后T细胞自身的安全性都至关重要。$ l( u5 S6 M* w: b
通过将识别肿瘤相关抗原（tumorassociated antigen, TAA）的scFv和胞内信号域“免疫受体酪氨酸活化基序ITAM在体外进行基因重组生成质粒，再通过基因转染整合到宿主T细胞中，使T细胞稳定表达肿瘤抗原受体，这类T细胞我们称为嵌合抗元受体T细胞（CAR-T细胞）。由于基因转导的方式不同，逆转率病毒或慢病毒的质粒通过DNA整合到宿主基因中以表达可稳定转染永久性表达CARs，而RNA插入只能瞬时表达CARs。今天大多数临床实验用为筛选的外周血单个核细胞（PBMC）T细胞体外扩增，这为产生足够基因修饰的T细胞提供保证。不同细胞培养系统能够生成众多的T细胞亚体，包括不同比率的原代、效应以及记忆T细胞[3]。近期，众多的方法已经用来分选不同的T细胞亚体，一种较好的操作方法（GMP）有助于更好的控制分选出T细胞的表型，以期研究不同亚型CAR-T细胞的活性。
& m/ m. K3 F6 p1 ^0 i+ R! o. H( DCAR T细胞的发展：
) S3 k; `/ o9 h% v2 \/ ?$ v. Z       CARs包含一组胞外绑定域，一组铰链域，一组跨膜域以及一组或多组胞内信号域（图1）。来源于肿瘤抗原反应抗体单链可变域（scFvs）通常作为胞外绑定域。所有的CARs包含CD3ζ链结构域，作为胞内信号域[4; 5]。第一代CAR 由识别肿瘤表面抗原的抗体单链（scFv）和ITAM组成，但研究表明第一代的CAR无法完全激活效应T细胞，且难以维持细胞的增值与持久性。第二代和第三代CARs除包含CD3ζ链结构域外，同时也包含共刺激域，如包含CD28的第二代CAR，以及联合4-1BB共刺激域的第三代CAR等，共刺激分子能够促进细胞的增殖，细胞因子分泌，抗凋亡，以及体内持久性杀伤效应。第二代CAR-T可以提高T细胞增殖能力，以及IL-2、IFN-r的分泌水平，但是只表现出短暂的肿瘤杀伤效应，对肿瘤的耐受性较低，引入4-1BB的第三代CAR-T细胞，表现更强的免疫效应以及体内存活的持久性[3; 4; 6; 7]。然而，第四代CARs，又称为TRUCKs或装甲CARs，联合了第二代CAR表达的细胞因子，共刺激配体分子增强抗肿瘤活性，以及降解胞外实体瘤基质的酶（图2）[3]，称为智能T细胞引入了包括一个自杀基因或者一个人造控制装置以提高CAR T细胞治疗的安全性，这类CAR-T 细胞已经应用到临床和临床前试验当中。
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Fig.2  Schematicrepresentation of a T cell receptor (TCR) and four types of chimeric antigenreceptors (CARs) being displayed on the surface of a T cell while contactingtheir antigen (red) on the tumor cell. The single-chain variable fragment(scFv) as ligand-binding domain mediating tumor cell recognition in CARs isshown in light blue with the VH and VL domains being connected via a longflexible linker and transmembrane domain to intracellular signaling domains.Pro-inflammatory cytokines or co-stimulatory ligands expressed by the CAR Tcells are depicted for the 4th generation3 b; E' h( h1 r  n" }8 P' _7 t- l
  研究者已经探索T细胞基因工程来表达嵌合抗原受体经历了20年风雨，2011年Porter等在三例难治进展型CLL（慢性淋巴细胞性白血病，chronic lymphoblastic leukemia）使用抗CD19 CAR-T细胞治疗后有两例获得完全恢复（complete response）。同一研究团队在四年后的研究中发现，CLL整体缓解率达到57%。近期研究结果显示，CAR T细胞治疗恶性血液病具有显著疗效，尤其是ALL（急性淋巴性白血病，acute lymphoblastic leukemia），达到90%完全缓解率，并且预后较好（sustained remissions of up to2 years）[8; 9]。其中著名的治疗案例莫过于艾米尔.怀特黑德（图3），五岁便诊断患有急性淋巴性白血病（ALL），在接受CAR T免疫治疗后至今已有5年无癌生存期(http://emilywhitehead.com)，这让人们看到了对癌症宣战的胜利曙光。这个令人鼓舞的实验促使了大规模的针对多血液抗原CAR T细胞（如CD19，CD20，CD22，CD30）的临床实验。在所有实验中，抗肿瘤活性与CAR T细胞在患者外周血中的持续与增殖活性相关，低效的体内扩增与存在限制了临床进程[3]。. g+ ?: Z5 i9 ]9 a
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Fig.3 Emily Whitehead with 5 years cancerfree
. c7 i* y' g3 ], k- pB细胞恶性肿瘤的免疫治疗靶位之一CD19，具有在成熟B细胞中有限表达的特征。相较于其他传统疗法，如放化疗，锚定CD19的CART细胞实验表现出良好、持久的临床疗效，患有ALL，CLL和其他B细胞淋巴瘤的患者用重组了抗CD19的CART细胞治疗后出现客观缓解。至今，众多的早期阶段临床实验已经用来治疗B细胞恶性肿瘤，然而至今仅有少数的实验聚焦于实体瘤上，且CARs治愈率多数出现在B细胞恶性肿瘤中。不幸的是，实体瘤临床结果并不令人满意，因为CAR-T细胞治疗过程中出现多细胞毒性以及极少的疗效反馈[8; 10]。
5 d. N: r+ K9 k# X一些实验清晰的总结出表面抗原蛋白和整合素与肿瘤关系，如癌胚抗原（CEA）的直肠腺癌，纤维母细胞激活蛋白的胸膜恶性间皮瘤，GD2的神经母细胞瘤、骨肉瘤，人表皮生长因子受体2（HER2）的HER2阳性肉瘤，间皮素的胰腺癌，白介13受体a的胶质瘤，异常avB6整合素的胰腺癌，等等。然而这些实验的结果仅仅令人满意。一些报道指出，GD2-特意的CAR T细胞治疗神经母细胞瘤，HER2的CAR T细胞治疗HER-2阳性胶质瘤（17例肿瘤切除的3例），EGFR的CAR T细胞治疗非小细胞肺癌（11例患者2伴随局部反应，11例患者2例病情稳定），CEA的CART细胞治疗CEA+肝转移（一例患者病情稳定，5例患者死于进展型疾病）（图4）[11]。
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Fig.4  Completedand ongoing CAR-T cell therapy clinical trials (per ClinicalTrials.gov)* Q' o/ I/ a2 `" J: G" f1 @& O' I
CAR-T细胞治疗现状：0 m% Z/ u; r, @% n2 U
         CAR T细胞治疗似乎是特别针对B细胞恶性肿瘤，这由于肿瘤细胞选择性、同源性表达CD19或CD20，与CAR T细胞有更好的亲和力。考虑到患者晚期极差的预后，CAR T细胞治疗CD19-阳性恶性肿瘤的临床反应较大。来自243患者（199成年人，44孩童）CD-19-CAR T细胞治疗后，客观反应率能够达到60%，仅仅20%没有反应（图5A）[3]。令人感兴趣的是，在包括孩童和成年人的实验中，实验结果不因年龄差异而不同。. {: S4 [9 O: S8 Z6 i) }
在5项实验中，有超过85%的包括ALL和非霍奇金淋巴瘤（NHL）患者达到完全缓解（NCT00968760，NCT01865617，NCT01815749，NCT01626495，NCT01044069）。有微小残留病灶（MRD）或形态学的患者，由浸润骨髓百分比分类。有趣的是，形态学疾病患者与微小病灶患者之间缓解率并无显著差异，然而患有MRD生存期明显较长。因此，低疾病负荷似乎促进CAR T细胞治疗持续性，至少在ALL中出现这种结果。
! ^& r- J+ G8 `2 h         因此，可以预先用化学疗法来减低肿瘤负荷，然后再开始CAR T细胞治疗，提供额外的治疗潜能。在ALL研究中，CAR T细胞诱导移植合并的疾病缓解率并不相同。尽管这些差异性和短期随访的限制，不同研究之间反应的持久性似乎非常相似，表明不管是否联合造血干细胞移植（HSCT），CAR T细胞均可以提供一个潜在的临床效益。
# e& A5 c1 b' f7 }+ N$ ]         总体来说，CD19-CAR T细胞似乎有一种偏好，能够有效治疗ALL患者，而对NHL来说效应则要小一些，并且慢性淋巴白血病（CLL）最低，表明疾病的类型对疗效具有深刻的影响。尽管起始阶段，CAR T细胞对NHL的治疗具有广阔的前景。包括9例高阶段耐药NHL疾病的混合病人中，其中4例获得完全缓解，另外2例获得部分缓解。Kita赞助的后续CAR T细胞实验最初结果证实了上述结论，4/7患者治疗后获得完全缓解，抑制性持续12个月。认为高阶段耐药NHL的预后几周中位存活期非常低迷。对于其他的血液恶性肿瘤抗原，临床疗效就没那么明显（图5A）[3]。5 O) r* h) L- p6 P. E$ \
         与血液恶性肿瘤的结果的差异性，实体瘤的治疗结果就没那么令人兴奋（12种不同抗原靶位），除了个别患者具有缓解率（图5B）[3]。极少的GD2特异的CAR T细胞案例，1期临床实验CR达到50%，有效的缓解神经母细胞瘤，给患者带来希望。
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Fig.5 Clinical outcome. (A, B) Best clinical outcome for hematological malignancies(A) and solid tumors (B) dependent on the targeted antigen. The number oftreated patients is provided in brackets below the targeted antigen. CR, complete response; PR, partial response; SD, stable diseaseD, progressive disease; NR, no response; NE, not evaluable.. ^; e4 X. N+ C/ I0 \* G/ ?: V

+ L$ Q! ^* T0 Q* q* T8 I1 SCAR T 细胞疗法与其它疗法联合
( v. Z$ y+ |4 T: v- q/ h- K       CART 细胞与其它疗法相结合具有增强其抗肿瘤疗效。例如，实体瘤免疫微环境（TME）中受体抑制后能够限制直接刺激方法的疗效，如细胞毒性T淋巴细胞相关联抗原4（CTLA-4）和PD-1。系统的应用此类抑制受体拮抗剂（封闭抗体）有利于显著提高难治实体瘤回应率，并且阻断抗体和CART细胞的联合使用有助于提高抗肿瘤效应。: d! @9 u7 C3 k" p% V6 O' m
       CART细胞联合其他药物打开一个崭新方法。目前，大多数临床药物治疗规定没有获得性细胞疗法（ACT）。因此，经管有许多机会联合ACT疗法，但是对于选择一个基于深刻了解合理的药物是至关重要的：免疫系统反应。来啦杜安已经表现出在病人多发性骨髓瘤中的抗肿瘤活性。当与CART细胞联合使用时，它能够增加CART细胞浸润到肿瘤并且提高IFN-r的产生和细胞毒性，进而导致完全治愈小鼠。所有维甲酸（All-transretinoic acid）(ATRA)可以诱导不成熟骨髓细胞分化，一种TME中肿瘤免疫抑制关键调控者。ATRA治疗的临床前研究已经表现出免疫抑制的不成熟骨髓细胞分化可以恢复抗肿瘤淋巴细胞功能。当在骨肉瘤异形移植中与CART细胞靶向GD2抗原联合时，肿瘤浸润MDSCs的比率与功能显著下调，导致一个改进的整体存活率（相较于GD2-CART细胞单独治疗小鼠），因此这种联合治疗很可能具有良好的实体瘤治疗前景。" ]( y; l8 N0 Y9 T/ E9 p
未来方向与应用前景：) v3 ^1 |& q8 |. J& V
       作为一个快速增长的新型肿瘤治疗方法，CART细胞疗法的发展已经有了不可忽略的进步，CART细胞疗法将肿瘤治疗带进一个新纪元。CART细胞治疗血液恶性肿瘤的高活性，特别是复发的B淋巴瘤，为患者提供一种可行的治疗希望。血液恶性肿瘤的成功促使研究者们利用CART 细胞治疗实体瘤。相较于传统的实体瘤治疗，CART细胞疗法有很对优点，包括卓越的靶向能力，跟耐用的疗效和不可思议的治疗周期。然而，实体瘤的应用仍然有许多障碍亟待克服，包括表达于实体瘤上的异型靶抗原使得特异抗原的靶位异常困难，实体瘤周围的物理免疫抑制因子阻碍CART细胞到达实体瘤，实体瘤分泌的趋化因子干扰绑定肿瘤的正确趋化信号方向，肿瘤微环境摧毁CART细胞功能，以及由于脱靶效应攻击正常组织[7; 11]。
3 S: Z9 ]0 }7 }: N! x+ R9 h       CAR T细胞实体瘤治疗的最终目的是治愈实体瘤，这要求新一代具有在肿瘤微环境中存活能力以及更有效持久工作特征[11]。目前， CART细胞实体瘤治疗研究已经大量开展，且一些临床实验也获得小的突破。针对目前的问题，已经有很多策略来克服这些问题。在可预知的未来，我们可定能够打破这些障碍，作为改善试验技术和更多的临床数据出现。
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