科学家开发出无细胞克隆新技术

bobo

日期: 2006-01-17 今日/总浏览: 1/517( l, ]! \2 `/ J+ x& J2 e
& U/ Q- y6 M: E: z+ |4 U
0 L+ f7 d/ z, a7 _- e
" t, l2 R$ I" w! b& u" t

9 {( n! A7 X! L; V' w2 G6 h5 B在滚环扩增过程中，研究者的一个细微但非常有价值的实验改进，导致了一种有用的无细胞克隆技术的诞生。) d, v6 ^( p* P1 Q( ^) [7 `
尽管人们正试图开发出DNA克隆与扩增的快速替代方法，但由于大肠杆菌这类方法的可靠性，它仍然是一种可供选择的有用技术。现在的问题是，这类方法的效果有时候并不理想。ClydeHutchison及其在J.CraigVenter研究所工作的同事就碰到了这样的情况。“我们手里有一些DNA片段，它们不能利用大肠杆菌这类方法进行克隆，因而迫使我们寻找像无细胞克隆这样的方法来解决问题，”Hutchison说。这样的情况是在利用29DNA聚合酶进行无细胞克隆的实验方法中得到了体现。
: d# a& v6 ?) P9 A  c7 d9 k3 K这些研究者非常熟悉29DNA聚合酶，因为他们以前的工作就包括合成一种X174抗菌素基因组。进行现在的研究很符合逻辑，因为早在2001年，Lasken及其同事就报道说他们开发的29滚环扩增法能够进行可靠的无细胞克隆。Hutchison指出：“我们认为我们应该可以完成单分子扩增的实验，但结果发现，在额外模板不存在的情况下进行DNA合成难度很大。”但是，通过大量降低反应量，他们最后克服了这一困难。这样以来，他们可对几个K长度的DNA单分子片段成功进行克隆，最终实现了双螺旋DNA的无细胞克隆。
5 \3 k2 K0 I0 J% x: b/ B3 J该方法的这一改进虽然细微，但非常重要，在很多应用领域中都非常有用。其中一个最明显的例子就是抗菌素的测序工作。Hutchison这样描述：“抗菌素携带有大肠杆菌的致死基因，因此通过大肠杆菌霰弹法对它们进行测序是存在问题的。”利用29DNA聚合酶，从系统中剔除大肠杆菌，然后进行滚环扩增，这样就克服了上述问题。已经引起人们关注的另一个潜在应用就是一家名为454生命科学公司开发出的一种新测序技术。
! S. w7 j% h  Y& F) m9 K2 q6 l: O3 Q( y* `! e9 J" }% S
在他们开发的“454测序”中，目标DNA被打断成碎片后固定下来，接着通过PCR方法进行扩增，然后被测序，整个过程不存在克隆问题。这样以来，就导致了大量“短片段阅读”的发生，而这些片段很难被完整拼接。虽然利用传统的测序方法可完成这些拼接工作，但是，对DNA片段进行必要的初步克隆工作，仍然是该过程中的一个瓶颈问题；如果你需要对一个基因组序列进行快速测定，将无细胞测序法与“454数据”联合起来应用就会加速实验进度。在Hutchison看来，“454生命科学公司正在开发其它方法，因而有可能使得这一应用的重要性大大降低，但我个人认为，这一方法仍然是非常有价值的。”# o  {% n# f+ l5 r0 A
2 W9 u. J0 I, J) \
注：夏雨译自2006年1月号的《自然-方法学》，版权为英国NPG出版集团所有。更多信息请访问：http://www.natureasia.com/ch/naturemethods
  r6 X0 n) g6 w  G5 T9 x# [9 j1 r7 E3 h" r
+ j0 u) r9 t! y0 c' O

$ {) r* t6 d8 `8 L9 m' f' i0 S1 ~+ n- M/ ~  e, |# [7 a. ~
0 {+ M* i; L3 r' K
作者: Daniel Evanko8 `3 ?' V/ D+ h
来源: 《自然-方法学》
$ I. l; L. w' F发布者: 刘斌