请教单细胞克隆遇上的问题

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目前最常用的挑单克隆的方法应该还是有限稀释法，最近在不断的重复种96板、看板、画圈，然后充满希望——失望——苦闷——重新再来的循环中。目前主要有以下问题：
- ~( J1 y5 W5 c; c  I0 ^- @- u. G1 `; ~1. 常规中止消化再悬浮后多长时间将单克隆种完合适？我平常做的时候先传代，然后剩0.5ml左右种单克隆，因为要细胞计数然后又种5-8块板，感觉细胞在超净台里好长时间，会不会活率都不行了？有什么合理的种板个数及时间规定吗？
; A! k5 N' s; I9 O9 t2. 选择看板的时间？我试过4小时、24小时及36小时看板，可以确定的是4 小时单个细胞可以贴壁，但是常常来不及在4小时后全看完（因为种的板多，秉持着多了总有成功的想法，也不知道对不对），而且看久了眼睛好痛。然后就24小时或36小时看，可是这时候的细胞有的开始分裂了，怎么确定是一个细胞分出来的还是这孔里本来就有两个细胞呢？) t9 D  q) \* F" H- X
3. 细胞长到什么程度传代？我查文献有看到说细胞20多个传代、100个左右传代的，我自己也试了试，20个的真的不靠谱，根本不长，100个的传代到24孔板，前2天长得还好，第3天开始就明显老化了，颗粒增多，然后5天就看不着细胞了。然后我想着是不是得在96孔板里再养养，就尝试一直养到第8天，细胞是多了很多，可是细胞状态又不行了，明显触角伸出来了，细胞也扁平变宽大了。怎么办啊？
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真诚的请教各位老师、高手们，请给一点指导、一点意见，谢谢大家了！刚开始做实验，有很多不懂的地方，一些专业用语可能也不对，请大家多包涵 - D( @. P; K4 y$ h: d$ @3 N

理科小文艺

同求

gxbzjznn

做得多的话，操作上容易失误，消化时间过长很可能是导致细胞活力不好的原因！下次建议先做一个板子！

淘知路遥

欲速则不达，做摸索实验要设计好方案，可以从一个变量因素开始做(接种密度或者培养时间)，加上一组对照，一块96板设计的好足以做一批实验

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淘知路遥 发表于 2017-8-24 09:22
$ A& d" N$ C  s! p欲速则不达，做摸索实验要设计好方案，可以从一个变量因素开始做(接种密度或者培养时间)，加上一组对照，一 ...

8 p$ V* |+ B* ^% h8 M; F2 n
哦，茅塞顿开，是的，可以合理利用96孔板的，谢谢！
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# ?6 l8 E. Y1 x还想请教，那什么时候传代合适呢？一般细胞长到多少能传代了？谢谢您！

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3 H- E4 M# H) F7 M! B. S
5 `' S- X9 P: Z# D5 Z6 I$ j* a谢谢！

淘知路遥

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; ~% _/ z( d; U, O% a! ]2 D1 |如果前期接种密度不好控制的话，接种后就每天观察，长到80-90%就可以传代了，正常贴壁细胞是接种后3-4天传代

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* K$ R$ i% x# I
6 T2 ]3 I3 t9 u, E" \" _) Y/ W谢谢！我没说清楚，我想问的是，如果单细胞克隆后，到什么程度可以传代？我现在遇上的问题是传代后增殖差，不是老化就是分化。

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+ }5 C3 y- y' ^5 h/ S
5 ^' K( e" c# X. D. V3 I嗯，你也做单细胞克隆吗？现在成功了多少个？我们可以一起交流学习噢。

随时准备下线

单细胞克隆我没做过，但是细胞老化或者分化，我觉着1、培养基与培养条件不合适，多数是培养基或者添加的血清不太合适；2、细胞传代密度问题，我都经验告诉我如果传代过稀，细胞似乎更容易老化。仅供参考。