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楼主

发表于 2009-11-5 10:25 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

小鼠胚胎干细胞培养. b2 X4 J) G# @  F9 ]
* S: D" o% g2 ^
1、  一般培养-保持胚胎干细胞处于未分化状态
培养基
细胞复苏
冻存细胞' k9 }/ r; O% w) D  E% h
明胶包被5 W- W: F* X- u% ^4 `- p
细胞传代( @5 Q) ?* t8 E, C3 `5 {& B; x

2 、体外分化) q! h; D, ]6 K5 K& c4 P
培养基
包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板（使用或不使用盖玻片）
体外分化方法

注：以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系，其它胚胎干细胞的培养可以参考。不过人的胚胎干细胞培养不可以采用下面的protocol，需要用专用的protocol和培养基。
, }. U1 f. m  X0 k4 H
一般培养--维持ES细胞处于未分化状态) |* F& \) n( h, }: J
ES 细胞培养用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed细胞的培养基（高糖）来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。如果在 Feed细胞，那么就需要采用MMC进行处理，抑制Feed细胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。下文中暂不提及Feed细胞。Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。2 S$ r( t7 M1 W9 A+ C) M

培养基. D* r) ]& E1 g! g! S/ X0 ?
ES:8 |( s) I6 I8 r! k
配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（该溶液也能用于 EB培养基--见下文）。分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。通过将21ml该溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制备培养基，0.22 μm滤膜过滤。贮存于4℃，时间不要超过2周。

贮存液1 K; v0 O8 h2 L  j6 J/ u; n( @" `
DMEM(高糖), ^9 V- b7 k$ |( X/ t- ?. v8 W3 ?
马血清（HS）- k$ Y( r0 X# V( g. f
L-谷氨酰胺（200mM）1 ?' z0 w# F3 ?6 H: T* d" p
MEM NEAA（10mM）6 D* }( B6 A( Z+ s" ?: v/ }
HEPES（1M）
β-巯基乙醇（55Mm）
PEST
LIF# q+ n' O$ v6 U2 n
' r" O- P/ q+ G& ]. m. ]
复苏细胞
细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。& y) E! I5 y: K" O: n

步骤：( B0 \. F7 p. {" n
1．从液氮中取出一管细胞；" F* \1 o$ s6 K+ U* l( Q8 Y
2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）；3 w" F' ^7 H$ N' b
3．将细胞转移到一15ml Falcon管中；
4．加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）；
5．离心3分钟；
6．弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次；! h. W7 [; N) z2 r3 T# b7 I) [
7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿；0 C0 H8 t) p$ ?, q
8．孵育。
4 A4 e8 m9 `8 I" c) ?0 ~' h
冻存细胞
冻存液
90％HS和10％DMSO
! g* v4 @6 w4 d! w& }7 p7 N; V2 M& o
步骤：
1．1×PBS洗细胞并留少许PBS在培养皿内；
2．用细胞刮刀收集细胞；
3．将细胞转入15ml 离心管管内并离心3分钟；+ _* w! B/ O6 z- x/ ~
4．弃去上清并将细胞重悬于冷的冻存液中（10 cm的培养皿用2ml，15cm的培养皿用6－7ml。）
5．分装于冻存管内，每管1ml；: h7 w; ^: g6 K7 u: T1 ?
6．置－80℃过夜，第二天移入液氮。3 c0 P  t! [' h
9 }1 M3 f% ?: x: ~  l
Geltin（明胶）包被
准备500ml 0.1％geltin溶液2 _' M1 S7 f, J5 p0 R- J0 S% B
1．将0.5 g明胶溶解在500ml无钙镁的PBS中（50－65℃水浴15～30分钟）。4 c0 Y3 _' B2 E# P: H7 P
2．最好在溶液没有冷却的情况下通过0.22 μm滤膜过滤，贮存在4℃。
包被培养板或培养皿
1．加入足量的明胶溶液覆盖培养平面（15 cm培养皿加2ml，10 cm培养皿加0.5～1 ml，溶液的量并不重要，只要能完全覆盖培养表面就行了。）；& V7 M* y( ]- q5 S. |
2．置室温30分钟；
3．去除明胶溶液，将培养板贮存在包装袋中室温放置，最好将板子平放或倒扣，以免明胶污染盖子和流出培养板。* d5 D% h7 s1 ]6 d# }9 j
0 N  M& U0 H, I2 L9 I& G2 p
细胞传代/ `3 H- b6 |, p% o" ?/ p$ P# y
建议每2天传代细胞一次，过度生长的细胞会降低细胞的自然分化率，我们建立了一种纯化方法来去除分化细胞，在将细胞接种在明胶包被的培养板上之前，通过将分化细胞黏附在没有包被的组织培养板上去除分化细胞。纯化步骤包含在下面的方法中。( n: t' E4 |7 c( o! _
% f. L( @% g7 o
1．去除培养液；, [" ?" ~( _" |, \+ x
2．无钙镁PBS（Gibco）洗涤；/ |' |0 ~8 {' W
3．加入胰酶EDTA（Gibco）。37℃孵育5分钟。
4．加入ES培养基使胰酶失活；
5．将细胞转入15 ml离心管中离心3min；
6．去除上清，将细胞重悬于2 ml ES培养基，至少吹打10－20次。
如果加入培养基的量较少会比较容易将细胞团弄散分开。ES细胞有聚集成团的倾向，传代过程中仔细将细胞弄散分开很重要。这样可能会减少细胞的自然分化。1 v, T; `7 A# j& _8 `  Y
7．将细胞接种在没有包被的组织培养皿中（使用和一开始同样规格的培养皿）放入温箱2小时（分化细胞在该时间内将黏附，而ES细胞仍将保持悬浮）；
8．将含有细胞的培养基转入geltin包被的组织培养皿。吹打以确保细胞被分散开（前面已经提到--ES细胞有聚集成团的倾向）* B+ T, b9 x9 I2 x' G! J# _
9．建议按1：4－1：10的比率传代 (ATCC)
保持细胞的传代比率很重要，以我们的经验，1：8的比率是好的，可以使细胞的自然分化降到最低。当你使用不同规格的培养板进行细胞传代可以使用表1来计算传代比率。9 B4 s7 p# H) \  w* h6 d

体外分化
胚胎干细胞在体内外可以分化为各种类型的细胞。我们的体外分化方法有利于神经前体细胞通过在最少量的培养基内选择（第3步），在有bFGF存在的情况下扩增（第4步）并最终分化在第5步。细胞全程培养在37℃，5％CO2，100％湿度条件下。一般体外诱导向神经细胞方向分化，也可以采用低浓度的RA进行诱导。; R) f5 y& k* O6 q* n4 p
时间线（总时间为27～34天）) R6 j( v6 B: F( B! ]4 P* Q1 z
第2步；4＋1天第3步；4－10天第4步；4天第5步；10－15天, ]4 g+ n' A, e2 b$ u( h1 I
: l( E* |+ ?. @! A8 B3 I
体外向心肌细胞方向分化. {  r- C. k' X6 b3 F9 R" e1 g
胚胎干细胞在体外去除LIF情况下会自然向心肌细胞方向分化，小鼠的R1系一般在第7-8天自然出现搏动的心肌细胞，与胚胎发育时间线是完全一致的。
& K3 I9 O. e9 j6 @+ t7 K
培养基0 p9 s" r# J! j7 W
EB# r9 B0 D' ?/ K7 w/ X' t
配制一20×不含DMEM，FBS，LIF的溶液（该溶液也能用于ES培养基--见前述）。分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。将21ml该溶液和50ml FBS加入450mlDMEM中制备培养基，0.2μm滤膜过滤。贮存于4℃。
贮存液9 n0 y( V% n, T( g1 P
DMEM(高糖)
胎牛血清4 i2 a4 m& U& o2 l/ ^5 K: \% T" J
L-谷氨酰胺（200mM）
MEM NEAA（10mM）
HEPES（1M）
β-巯基乙醇（55Mm）1 G' o- h# Z) R9 F& e6 R* I
PEST（P104U/mlS104μg/ml' P( W" r1 N! [, p" a* b

ITSFn and N3（分化培养基）：
配制一20×不含DMEM/F12的溶液。分装在15ml 离心管中，（稀释为1×，ITSFn 7.05ml，N3 12.55ml），0.2μm滤膜过滤，贮存在-20℃。将该溶液加入DMEM/F12中制备培养基，贮存于4℃。7 I7 x) j3 \) q3 ^# F$ Z( ?# c
贮存液5 c9 J" D9 |3 I
DMEM(高糖)
转铁蛋白50mg/ml  P9 M% B5 R9 N
胰岛素5mg/ml
亚硒酸钠300μM$ }. H! ^" {# Z# `3 C4 d- ]
黄体酮（20μM）
腐胺（100μM）) k5 }* X2 j4 O5 k" y6 R
PEST（P104U/ml S104μg/ml）* ?; n$ F/ Q$ f7 [' ^
层粘连蛋白100μg/ml# D# X7 Y2 s. y% C9 o7 E4 W6 m( f6 ?
纤维连接蛋白250μg/ml* I* C  k+ `. M9 Y
碱性rhFGF, 10μg/ml
*在第4步将bFGF加入N3培养基使终浓度为10ng/ml。9 s$ l% A9 f4 G: P2 A  }! ]+ g" s

ITSFn and N3培养基贮存液的准备
使用无菌的溶剂和稀释液，在分装之前要对溶液进行过滤，如果因为某些原因溶液在分装之前没有进行过滤，需要在管子上标明以便别人在使用时知道该溶液不能直接用于细胞培养。
贮存液溶剂，贮存液，稀释剂和储存5 ^$ q/ i  }. {# i
转铁蛋白50mg/ml* q+ A# [& ^/ l
胰岛素5mg/ml
亚硒酸钠300μM
黄体酮（20μM）
腐胺（100μM）' B# d. G" P' Z! j% O* a, d
PEST（P104U/ml S104μg/ml）$ j0 m1 k" I. B* ?* W
层粘连蛋白（100μg/ml）
纤维连接蛋白（250μg/ml ）, h: j  `. b# W; F! v% q
碱性rhFGF, （10μg/ml）
, z) N1 c2 G1 }, c( ]& Y
包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板（使用或不使用盖玻片）: f5 T( h0 U& [; v

包被液的准备
多聚-L-赖氨酸，15μg/ml
把75ml多聚-L-赖氨酸和425ml 1×PBS混合。贮存在4℃。3 g9 j& ~  I1 p; o
纤维结合蛋白，1μg/ml
把0.5ml纤维结合蛋白和500ml 1×PBS混合。4 F6 C- u/ O7 @; V! f

包被过程：0 v( \: k# ^$ c, P
1．加入多聚-L-赖氨酸，至少2－3小时（过夜也行）7 n1 `# k9 e  s9 B3 v
2．吸出多聚-L-赖氨酸
3．加入纤维结合蛋白，大约1－2小时
4．吸出纤维结合蛋白，放置30分钟晾干
5．贮存在4℃
24孔板用200μl，6孔板用500μl。震荡培养板确保溶液能够覆盖盖玻片或培养孔。有时需要剧烈震荡培养板。# ^+ B# u& S) _
" b  q0 g$ [/ z
体外分化方法

第1步：ES培养基
在LIF存在的条件下维持细胞培养

第2步：EB培养基
使用细菌培养皿去除LIF后胚状体的形成需要4天。. S7 w) [) t: }' l+ T4 n
1．分散纯化细胞（参见上面的细胞传代部分）2 N2 }5 x7 K5 q" G3 X
2．纯化2小时后将细胞转入含有ES培养基的50ml Falcon管中，计数细胞取适量体积放入15ml管中离心3分钟。! E# G) T7 t7 z7 c. U3 I$ Y" S
3．用2mlEB培养基重悬细胞，吹打至少10次制成单细胞悬液; Q1 r, U0 {/ V6 Y
4．一个15cm的细菌培养皿接种4～5×106个细胞（1个完全融合的组织培养皿通常足以接种4个同样规格的细菌培养皿）。+ c& s+ U" j5 o' K+ U
5．2天后更换培养基
将胚状体转入锥形管中放置3～5分钟使细胞沉降。弃去上清，将细胞重悬于新鲜培养基并接种在新的细菌培养皿中。
6．用EB培养基培养的第4天将细胞转入没有包被的组织培养皿中（这即是细胞的移植步骤）。1个组织培养皿之中放置1个细菌培养皿，在进行第3步之前一天将胚状体黏附在同样规格的培养板上。& z0 L0 u! e6 M4 y* x
形成胚状体需要4天时间。在EB培养基中再培养1天使胚状体粘附在组织培养皿的表面。这一天被认为是第2步和第3步的分界。, y  E$ w6 _' a  Z$ i* U' m( O
, o1 h$ z9 C- K5 r( m, u) Z8 O3 m
第3步--ITSFn培养基
在最少量培养基中选择神经前体细胞
1．在胚状体接种在组织培养皿一天后将培养基换成ITSFn培养基2 ^' Z; C; s+ z2 h; ^
2．并非所有胚状体在这一时期都已经发生粘附，因此在移除培养基时要小心谨慎以使大部分胚状体留在培养皿内。
3．保持细胞在ITSFn中培养大约10天，根据需要更换培养基--大约每隔一天。- ?9 o; s5 A3 D1 H2 [
观察细胞形态，神经样细胞大约出现在第4到第7天。当神经样细胞能够被鉴别时，转入到第4步。步骤的转换应该在神经前体细胞出现第一个清晰的标志几天以后，通常是在第3步的第6到第10天。* f% t2 c7 U" j: }

第4步－N3培养基＋bFGF+ x8 l6 _4 \" d5 x; L. |) u* r3 F
通过将神经前体细胞培养在含有10ng/ml bFGF的培养基中进行扩增。
1.PBS洗涤，加入1-2ml 胰酶
2．37℃孵育5分钟3 ~2 _0 r8 B% `& l3 y& c
3．用4mlEB培养基终止胰酶活性，将细胞转入锥形管中放置3～5分钟移出细胞团，将上清移入一新的离心管离心。
4．将细胞重悬于含有bFGF的N3培养基。
5．将细胞接种在包被多聚-L-鸟氨酸/纤维连接蛋白的盖玻片上（最好将盖玻片放于24孔培养板或6孔培养板，6孔培养板中每孔放置5个盖玻片如果是塑料的放置4个，以使最大可能的获得样品数量）。24孔板接种3.5×105/孔或6孔板1.7×106/孔。6 {3 C6 x+ B. y
6．2天后更换培养基$ C3 I0 N2 E0 x# ~4 u/ B, A/ k: M+ a

第5步－N3培养基6 u7 [& E1 D# b. h/ I' {. h
通过撤除bFGF使神经前体细胞分化
1．细胞被接种在盖玻片上4天后将培养基换成不含bFGF的N3培养基$ X8 r9 u* W# |$ v. F
2．根据需要换液（大约每隔一天）# o) e$ J! ~4 b# n
3．分化10～15天后固定细胞
移除培养基5 W. L+ f9 ?' n! A
PBS洗涤
加入4%福尔马林
室温放置30分钟
PBS洗涤2次: T3 V3 b: H* k" ?( b$ O8 t  m3 s
储存于PBS。长期储存使用含0.01％叠氮化纳的PBS3 ?9 `, R' @, a( Q0 p, M( ]+ W
移植细胞的准备
细胞在胚状体形成4天以后被移植（相应于体外分化过程中的第2步末细胞被转种到组织培养板）。正如在前文体外分化中所描述的在移植之前4天开始形成胚状体。通常再需要一天时间以便将胚状体移植入一10cm的培养皿。

移植( M$ I- `+ W8 c7 A2 g' k2 h
1．将胚状体转移至一15ml 圆锥形管中放置3～5分钟使胚状体沉降下来。& m9 i5 ?8 [/ v; L8 c
细胞被离心3分钟会更好。放置使之沉降将会去除更多的单个细胞（包括死细胞）而这些细胞可以被离心下来。; k& i3 H8 x3 ~, F  W2 W0 L  @  r
2．去除上清将胚状体重悬于无钙镁离子的1×PBS中3 R6 G1 q: ?1 [- s2 u- @
3．离心3分钟# G3 x& A* c% d! E
4．去除上清加入1×胰酶（10cm的培养皿加1ml）" @+ M: x) |# n7 M
5．37℃水浴5分钟
6．加入5mlEB培养基小心吹打约10次
小心处理细胞很重要，进行细胞传代分散细胞时不可剧烈吹打。
7．离心2分钟( b! A7 f7 ^. G
8．吸出上清将细胞重悬于500μl EB培养基
9．用光滑的巴斯德吸管小心吹打5次
10．离心2次
11．吸出上清将细胞重悬于100μl EB培养基3 }  r( v+ W+ B# u/ `* F. w

烟酸己可碱标记ES细胞进行移植1 j+ A% J8 h1 H7 o# P
1．准备一10μg/ml的烟酸已可碱染液（双苯酰亚胺，在冷冻室118）
2．加入1mg（你能称到的最小量）到5ml EB培养基（制成200μg/ml）4 D( P- h1 w/ @8 N& k7 H! _
3．将溶液稀释成10μg/ml （100μl 200μg/ml 溶液和1.9ml EB培养基）0 F  c+ z; N- W
4．如前所述将细胞重悬于2ml烟酸已可碱染液而不是EB培养基中制备ES细胞悬液，
5．将悬液置于室温（或冰上）30分钟9 C" E" H7 Z! o$ q$ F
6．离心2分钟
7．吸出上清将细胞重悬于2ml EB培养基
8．重复一次+ O8 \5 u$ z$ d; [# }; i7 Q- H
9．离心2分钟' V  X# e, l0 ^
10．吸出上清将细胞重悬于100μl EB培养基并置于冰上。
1 胚胎干细胞为何呈克隆性生长，而不是铺开生长？这是由胚胎干细胞的什么特征决定的？6 G7 d+ b! L" W1 l. J
2 胚胎干细胞的定向诱导一般都通过拟胚体途径，请问与不经过拟胚体途径直接诱导有什么区别？
3 胚胎干细胞在没有LIF时很快分化，从实验中看这些细胞分化后很快死亡，不知这些分化后的细胞都是些什么细胞，为何如此短命？. }4 c/ O: h* l/ i
4 看文献上的胚胎干细胞定向诱导分化，都是多少天到多少天加某个细胞因子，是不是有点玄乎？如何知道细胞的分化到这天就需要这个细胞因子，而过了这一天就不需要了？
我对楼主的第2,3,4问题发表个人理解:0 |# B5 z% M. y# X  k
2 ?7 C/ I  x- {, U% d. \, `
2. 胚胎干细胞(为方便, 下简称ES) 定向分化研究的经典途径是: 扩增ES后, 撤去LIF, 继续悬浮或悬滴培养2--5天, 形成拟胚体(E B ), 然后用不同的措施定向诱导分化为目的细胞. 之所以经EB途径, 目的是模拟体内胚胎发育过程, EB中内中外三胚层的细胞互相支持, 互相提供分化生长的微环境. 近3年来, 陆续有文章报道不经EB途径, 直接诱导ES分化亦可获得目的细胞, 同时指出EB的空间立体结构使分化所得细胞含有大量不同分化时期细胞, 有悖高效性原则. 但目前主流还是使用经典途径, 包括06年在Nat.发表的几篇有关ES定向分化文章.% X* I7 k+ O+ z; w: g( L8 C! k
4 ?7 @/ P. ^1 ]
3. 经EB途径得到的细胞"短命"原因, 与细胞接触抑制有关, 也与因空间受限不能良好的吸收培养基营养有关.4 ]2 c. T' h5 ~% B" j4 _
7 ]9 D$ Y- l+ w& B* g7 m
4. 目前ES定向分化研究极不成熟, 程序性添加诱导因子的依据是, 在胚胎中这些因子是程序性表达的, 如向肝脏分化先表达FGF,然后表达HGF, 体外实验就先添加FGF,然后添加HGF, 其目的是模拟体内胚胎发育过程.8 `) i* }7 P' b0 ^2 k
1 胚胎干细胞为何呈克隆性生长，而不是铺开生长？这是由胚胎干细胞的什么特征决定的？" m% A2 H, ]+ a$ ^$ t0 g
这个问题没想出来，不知是否与其来源（内细胞团）有关，细胞连接？
2 胚胎干细胞的定向诱导一般都通过拟胚体途径，请问与不经过拟胚体途径直接诱导有什么区别？+ }; E+ Q" I8 X+ d. @) i3 O
两种方法的目的都是一样的，呵呵，那就是拿到纯度高，活性好，数量多的目的细胞。
拟胚体途径是经典途径，拿到目的细胞的机会很大，但纯度不会太高，在首次定性试验中建议使用这种方法。直接分化是一个尝试性的工作，得到的细胞纯度大，但功能和活性往往有一定的问题。
3 胚胎干细胞在没有LIF时很快分化，从实验中看这些细胞分化后很快死亡，不知这些分化后的细胞都是些什么细胞，为何如此短命？0 V  Z! m3 E) `/ p. g$ {
自己认为是细胞进行了选择，也就是说不符合条件（筛选培养液）的细胞多数死亡（主要根据丁酸钠诱导ES细胞分化的试验）。当然，LIF是否起到了抑制凋亡的作用我没查文献，有可能。: s* _* s# V0 j: h( g  R
4 看文献上的胚胎干细胞定向诱导分化，都是多少天到多少天加某个细胞因子，是不是有点玄乎？如何知道细胞的分化到这天就需要这个细胞因子，而过了这一天就不需要了？
就像scalpel3所述，这个也是摸索出来的，因为拟胚体的分化部分模拟了体内胚胎发育过程，所以对于一些发育机制比较清楚的可以采用不同时间添加不同的细胞因子和细胞外基质的方法进行诱导。8 Q/ O- ]8 d. j1 Y3 M8 ]$ `5 e
楼主的问题看起来都是些基础的问题，但是细想起来还真是不是那么好回答。
1. 我觉得干细胞石油内细胞团进一步发育而来的，而内细胞团和滋养层的分化可以说是胚胎发育过程中的第一次分化了。因此可以说是有较大的同源性，之间有较大的细胞粘性。所以在成纤维细胞组成的滋养层上相互吸引黏附在一起生长，而且在体内内细胞团开始也是这样生长的，再慢慢的发生分化。* V5 y$ q; H; r9 V" y$ T" I
2.同意楼上的观点，解释得很详尽。具体应用何种方法分化视情况而定。例如：ES向精子分化的过程没有经过类胚体的阶段、而向卵母细胞的分化却经过类胚体来完成。
3.LIF作为一个细胞因子起作用非常广泛，既可以参与细胞信号传导抑制干细胞分化、也有刺激干细胞增殖的功能。分化出来的细胞应该说包括三胚层的所有细胞类型，只是我觉得这些细胞并不一定很快死亡，死亡的只是少数，可能与这种细胞类型不适合这种培养环境有关！
4.同意楼上的看法，只是想补充一点，现在所采用的分化方案并不是一蹶而就想出来的，应该是通过很多研究人员经过很长的时间摸索出来的途径。而且可能仍然存在问题，有待改进。$ L4 `* u  o, D# r7 I; J
1 胚胎干细胞为何呈克隆性生长，而不是铺开生长？这是由胚胎干细胞的什么特征决定的？  I/ ?/ Z( o/ [3 U
我简单说两句,仅供参考.
这和ES细胞的癌细胞特性有关.ES这种克隆性的增长可以满足细胞生长需要的营养以及细胞之间的通信和交流.这种集落式的生长最后使细胞处于细胞的特定阶段,维持细胞之间特定基因的表达.: ?, A2 y* t( h7 `. L
呵呵..........- g8 V0 B, H+ V+ f6 I  E6 f
非常稀饭这样的帖子!不是搞es的,也想讲几句,嘿嘿!
我对第一个和第四个问题感兴趣,(不是来回答问题的)
1, 这个问题的提出真是太不容易了,佩服楼主的思维!前面两位兄弟的想法很有道理,但我有自己的看法,es细胞算是干细胞里面级别相当高的细胞了吧,只有它才能最后发育成为一个个体,而一个个体的形成最重要的一方面是其三维结构的形成,所以es这种集落样生长的现象就它的一个相当重要特性的表现,也只有具备了这个特性才能促使完整个体的形成,对这种现象的深入认识对于从另一个角度认识发育不是很有趣么?很荣易想到的,这个现象的背后肯定是细胞间通信的原因,单方向的通信肯定完成不了,所以细胞间的交流和反馈我认为是es所独有的;; o: w, j% a4 A5 D
4.这个问题有点玄乎,可事实就是这样,或许分化调控的过程并非我们所认为的那么复杂,或许就是因为这一两个因子的关键作用在其中发挥着决定性作用1 C1 K- b* {; }  P) @9 M( n
请问胚胎干细胞克隆、拟胚体和已分化的胚胎干细胞细胞团（非拟胚体）如何在形态上予以区分？: d/ F( ~6 n( F% L( @! a
有文献提到，胚胎干细胞克隆除去lif后，可以在STO上直接分化为拟胚体。我想知道胚胎干细胞克隆分化到什么程度就是拟胚体了？
这个问题还是我来回答吧，毕竟后者是俺们做的。  U% E- |% g5 {# ?$ B5 K
典型未分化的小鼠胚胎干细胞克隆成典型的集落状；如果发现细胞团比较扁平或细胞团周围有纤维样细胞，则认为细胞已经开始分化；拟胚体的形态比较好看，圆球形，如果分化方法妥当的话，可以看到分为内外两层，外层为原始内胚层细胞。如果是在STO细胞上形成的拟胚体则早中期呈现半贴壁状态，晚期则呈现悬浮状态。( L: Z" Y, q. x. y( T! C. u
关于拟胚体的说明，一般认为细胞聚集成团后，首先呈现simple EBs（简单拟胚体）；而后随着外层细胞的分化，内部逐渐出现空腔，则称谓cystic EBs（囊状拟胚体）。

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