关于MTT的若干问题~~

angel-sakura

问题一：目前我找到的MTT改良法有两种，其一是周建军的“评价抗癌物质活性的改良MTT方法”，具体配方是：三联溶解液：SDS10g，异丁醇5ml，10M HCl 0.1ml用双蒸水溶解配成100ml溶液。其二是安云飞的“改良MTT法检测HePG22 细胞增殖的研究”，其配方是：。pH 调节混合液:取盐酸1 ml ,冰醋酸9.6 ml ,加水13.4 ml 。甲
# z# |$ z2 E9 d/ b0 w+ s瓒裂解液:于200 ml 体积分数为50 %的DMF 溶液中缓慢加入SDS 28 g ,经磁力搅拌充分溶解后,普通滤纸过滤,pH 调节混合液调pH 值至4.7。我想请问下做过MTT的前辈们，哪种方法可靠些？不知道有没有人比较过MTT和改良的MTT之间的优劣？6 ~9 _! Q/ Y% ]5 T% Q9 E
问题二：关于加MTT试剂之前培养细胞的培养液之问题，我看了一些资料说含血清的培养液可能会对测量值造成影响，但如果我的空白组也是用的含血清的培养液，那么是否能抵消这个的影响呢？. d) R( b1 \* U* s" J9 S. D
谢谢！！！

xbs530515

MTT裂解液，我用过DMSO、10%的SDS、酸化异丙醇，个人感觉如果是贴壁细胞，可以直接使用DMSO，最后的OD值要高一些。如果是悬浮细胞，推荐使用酸化异丙醇，操作较方便，直接加进去吹打溶解即可。不建议使用10%的SDS，我做了几次，吹打过后，泡沫较多，影响读数。' I" S4 r. p4 ^# E3 ^8 _, d
血清可能有影响，但正如你说的空白也有，可以不用考虑。

angel-sakura

回复 2# xbs530515 $ i, [+ Q6 F( o. M$ g
谢谢你的解答，请问你是用的我说的MTT改良方法吗？我养的是BMSC，贴壁不是很牢，因此如果加DMSO溶的话，OD值有点偏小，且若干空甲瓒丢失严重！/ Q3 o* |( }# l/ J, z/ r
这种改良的MTT法能否用于贴壁的细胞呢？是否直接加DMSO对于贴壁的细胞来说要比改良的方法好些？
8 ]& S8 z- C) M) ]. A# z# w3 ^" j此外，有气泡的话你是否试过在摇床上摇10min以去除气泡
+ p# t5 X3 D# H: L+ Y4 |3 J! n) b  e再次感谢！

bingo

为什么不直接买公司的MTT粉末呢？价格不高，配制也方便

angel-sakura

回复 4# bingo ' {# I# D' [( u: s, N& x* M: g7 O

) u. U  `6 j) ]- y$ r! e我用的就是MTT干粉，但问题不是这个，我用DMSO溶解甲瓒之前要去除培养液，就是这里损失甲瓒晶体太多，我是用滤纸倒吸的方法去除培养液，但因为BMSC贴壁不是很牢，故老是有损失，但改良的这种方法就不用去除培养液而直接加，但不知道效果如何

angel-sakura

回复 4# bingo ( x8 V" F# u. h2 h6 r) Z# s
- w5 a. F! |/ l7 n, ?, b
这个是具体的方法
/ V7 @! d  x4 E7 a    用以下文献方法：周建军等，评价抗癌物质活性的改良MTT方法，中国医药工业杂志，1993，24（10）：455-457. {$ X; q8 g3 |, A# w8 n$ D
具体方法：
+ D4 ]7 z' I$ C% p' g/ `配三联溶解液：10%SDS，5%异丁醇，0.012mol/LHCL，蒸馏水溶解。
- o  Y, J; v' W: R8 N- a三联溶解液：SDS10g，异丁醇5ml，10M HCl 0.1ml用双蒸水溶解配成100ml溶液. U3 r* n4 Y( s; Q! W5 S
操作：在培养板上加一定密度的细胞悬液，90ul/孔；如需给药，则再于同时（悬浮细胞）或4h后（贴壁细胞）加入不同浓度的药物10ul/孔，均设三复孔。另外，每块板上另没一个调零孔（只加培养液，不含细胞和药物）。培养2d后，加入MTT溶液20ul/孔，继续培养4h，然后加入上述三联液100ul/孔，于37度放置过夜后，用酶标仪测各孔A570值。

bingo

啊哦，你的MSC养在什么上面啊，我也做MSC，没有发现损失的现象哦，反而要溶解很久才能把甲瓒溶解完全。

angel-sakura

回复 7# bingo
. H& y( Z, m3 u, b4 F5 m5 W# c" w( F/ p
  s& P3 N8 M* `: B3 A! Y' s
    我是用一次性的培养皿养的，我也不知道为什么，总之甲瓒一不注意就回流失。平常养细胞的时候细胞贴壁倒是蛮好的。我听说用过MTT后细胞形态会消失，不知道是不是这个原因。你测MTT的时候OD值一般是多少？我最高的0.3左右，不到0.4.而且有很多孔的OD值与空白对照相似。

bingo

一般的空白是0.035左右吧，一般实验都是0.2~0.4之间，没有太高的。

kqyy

我测过兔的MTTs生子曲线,密度变化太大,最后发现800--1000个细胞/孔效果比较好,OD基本分布在0--0.7，密度高的都到了1.4。我是采用经典的方法，没改良。7 {+ ?4 F+ M3 r2 |8 I: V
    另外，BMSC贴壁是很牢的。, O) w9 T- k( V/ R0 N9 `. O* |
    此外，我没注意用过MTT后细胞形态会消失的问题。
7 B2 m" C3 {/ d  }0 j    值得很定的是滤纸倒吸的方法去除培养液可以减少甲瓒损失。
/ ^) ~3 r! c4 J: B    建议有2：& V+ V. b, z  C1 @  p, I( M
          1；种植密度梯度5 ~5 q- Y+ L- O5 b* V- f0 \9 I
          2；空白对照设置