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关于脂肪干细胞实验的几点疑问 [复制链接]

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楼主
发表于 2010-3-17 19:31 |只看该作者 |倒序浏览 |打印
下面是我们做实验时的基本步骤:
) g3 @$ k$ J. U! i" y1、取人脂肪100ml7 ^: [+ o) t0 }' u
2、配制collagenase solution 80ml(0.16g)
2 w, u# G+ G& k7 X7 x; ?/ e3、用1Xpbs清洗脂肪,剪碎,等体积加入collagenase:脂肪=1:1
* n; O9 ~  J+ H/ R; H/ A4、37摄氏度,水浴,溶解脂肪
9 ?" F( a. K' C" S5、过滤,加入到等体积的DMED(10%PBS 1%P/S)) L6 ~0 W$ a& c  {5 g
6、3000转,3分钟,离心。取上层液与沉淀物分管继续加DMEM离心,同样转速和时间。共三次
) @2 U) m  U/ X, T; ~7、最后一次离心后取出,可见有红色物质沉淀于最底部,红色物质上为薄薄一层白色薄膜样物质,最上层培养液。, U5 \3 a. e0 a
8、吸取白色薄膜层后,用DMEM于培养皿中培养。
+ s* ?4 T; O" n% N% A7 ~( i& d- l# p5 E
想请教一下,这些步骤有哪里是错误的,有哪里是操作时要十分注意的?
' V" b! }; P2 E4 `$ K6 p" G7 c0 ^问题:1、剪碎的脂肪应该与等体积的collagenase相混合吗?
$ }" L- q$ H' b8 z! X2 I      2、溶解脂肪时,应该用时多少?如果根据脂肪的多少来算,是怎么样的一个比例; b( q: i/ p; ?% E% |
      3、离心的时间有没有问题?
5 O: h3 l# g$ b; K      4、清洗脂肪时,需要清洗几次,到什么样的一个程度为宜?* B5 W, V! T( o4 v$ ^* T; M
      5、最后为什么会出现较多的红色物质,是因为没有清洗干净吗?7 w7 J3 J4 H6 h) [2 i6 g/ q6 x
望各位前辈赐教!谢谢!
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沙发
发表于 2010-3-17 20:22 |只看该作者
1.我想问下你用什么方法取的脂肪,脂肪组织的单位为什么是ml?
2 t9 F  \( Y" t9 U: W; X2.你的胶原酶终浓度是0.2%?个人意见0.1%就够了,0.2%太强了。酶和脂肪组织的体积比>2:1为佳。
. X8 @5 {* @- g% f/ u- R7 b9 z3.离心3000转对细胞损害比较大,建议你转速调低点,1000-2000转,离心时间可长一些,5-10分钟。8 ?- O. t4 K8 L4 c
4.PBS清洗1-3次就够了,但是消化前最好将肉眼可见血管剪除,这样离心后沉淀里血管内皮和红细胞就少,不会那么红。
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藤椅
发表于 2010-3-17 20:58 |只看该作者
学习了,谢谢

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板凳
发表于 2010-3-17 21:29 |只看该作者
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回复 2# cm11011
" I+ H9 \* b% r/ F( T- b7 C4 g2 }
$ \1 V: e7 Q" }; j
+ w$ L7 p9 T4 `2 ~- N$ J    你给的一件很受用,非常感谢% b5 [9 ]/ i) G9 i4 O; \& J
我们是直接从手术病人身上提取的脂肪,马上拿回实验室提取。单位是ml
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金话筒 优秀版主 专家

报纸
发表于 2010-3-18 09:08 |只看该作者
1.如果是从人体内抽提的脂肪,没有必要再用剪刀剪了,因为已经是乳糜微粒状。
+ ~* X" q) K. O& T! W2.胶原酶可以是0.15~0.2%,与脂肪(离心弃下层水溶液的纯脂肪)1:1.6 K! r6 v5 m( S' c8 Y+ t/ \" c. `3 `
3.离心转速1800g就可以。
. R8 G( T4 k4 ~8 a+ G$ y4.红色物质是因为脂肪中红细胞太多,如果红细胞过多建议裂红。3 e9 B8 n; Y0 N/ o. c! x
1 I7 l$ D' n" S. M) J& W5 P
以上是自己重复了n次的成功经验,值得借鉴。
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地板
发表于 2010-3-18 09:45 |只看该作者
回复 5# yuheng * o- A2 F3 c9 l
非常感谢!

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发表于 2010-3-26 22:52 |只看该作者
感谢了

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发表于 2010-4-12 22:58 |只看该作者
我用的是0.1%胶原酶,但是消化下来的不贴壁,为什么?换成一次性瓶子还是不贴壁,郁闷,我是交大医学院的学生,qq:290036556,养脂肪干细胞,还是没出来,请各位高手,给予指导,非常感谢,电话:15091057632,电子邮件:jiwenchenbaoyan@163.com
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发表于 2012-9-24 16:20 |只看该作者
回复 yuheng 的帖子
* `. ]! H) X0 p4 x7 a' p
- ]) \! C5 v+ E版主是离心后弃去上层纯脂肪留然后重悬下面的沉淀吧?
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