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下面是我们做实验时的基本步骤:
) g3 @$ k$ J. U! i" y1、取人脂肪100ml7 ^: [+ o) t0 }' u
2、配制collagenase solution 80ml(0.16g)
2 w, u# G+ G& k7 X7 x; ?/ e3、用1Xpbs清洗脂肪,剪碎,等体积加入collagenase:脂肪=1:1
* n; O9 ~ J+ H/ R; H/ A4、37摄氏度,水浴,溶解脂肪
9 ?" F( a. K' C" S5、过滤,加入到等体积的DMED(10%PBS 1%P/S)) L6 ~0 W$ a& c {5 g
6、3000转,3分钟,离心。取上层液与沉淀物分管继续加DMEM离心,同样转速和时间。共三次
) @2 U) m U/ X, T; ~7、最后一次离心后取出,可见有红色物质沉淀于最底部,红色物质上为薄薄一层白色薄膜样物质,最上层培养液。, U5 \3 a. e0 a
8、吸取白色薄膜层后,用DMEM于培养皿中培养。
+ s* ?4 T; O" n% N% A7 ~( i& d- l# p5 E
想请教一下,这些步骤有哪里是错误的,有哪里是操作时要十分注意的?
' V" b! }; P2 E4 `$ K6 p" G7 c0 ^问题:1、剪碎的脂肪应该与等体积的collagenase相混合吗?
$ }" L- q$ H' b8 z! X2 I 2、溶解脂肪时,应该用时多少?如果根据脂肪的多少来算,是怎么样的一个比例; b( q: i/ p; ?% E% |
3、离心的时间有没有问题?
5 O: h3 l# g$ b; K 4、清洗脂肪时,需要清洗几次,到什么样的一个程度为宜?* B5 W, V! T( o4 v$ ^* T; M
5、最后为什么会出现较多的红色物质,是因为没有清洗干净吗?7 w7 J3 J4 H6 h) [2 i6 g/ q6 x
望各位前辈赐教!谢谢! |
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