关于脂肪干细胞实验的几点疑问

duoduo777001

下面是我们做实验时的基本步骤：
) g3 @$ k$ J. U! i" y1、取人脂肪100ml7 ^: [+ o) t0 }' u
2、配制collagenase solution 80ml(0.16g)
2 w, u# G+ G& k7 X7 x; ?/ e3、用1Xpbs清洗脂肪，剪碎，等体积加入collagenase：脂肪=1：1
* n; O9 ~  J+ H/ R; H/ A4、37摄氏度，水浴，溶解脂肪
9 ?" F( a. K' C" S5、过滤，加入到等体积的DMED（10%PBS 1%P/S）) L6 ~0 W$ a& c  {5 g
6、3000转，3分钟，离心。取上层液与沉淀物分管继续加DMEM离心，同样转速和时间。共三次
) @2 U) m  U/ X, T; ~7、最后一次离心后取出，可见有红色物质沉淀于最底部，红色物质上为薄薄一层白色薄膜样物质，最上层培养液。, U5 \3 a. e0 a
8、吸取白色薄膜层后，用DMEM于培养皿中培养。
+ s* ?4 T; O" n% N% A7 ~( i& d- l# p5 E
想请教一下，这些步骤有哪里是错误的，有哪里是操作时要十分注意的？
' V" b! }; P2 E4 `$ K6 p" G7 c0 ^问题：1、剪碎的脂肪应该与等体积的collagenase相混合吗？
$ }" L- q$ H' b8 z! X2 I      2、溶解脂肪时，应该用时多少？如果根据脂肪的多少来算，是怎么样的一个比例; b( q: i/ p; ?% E% |
      3、离心的时间有没有问题？
5 O: h3 l# g$ b; K      4、清洗脂肪时，需要清洗几次，到什么样的一个程度为宜？* B5 W, V! T( o4 v$ ^* T; M
      5、最后为什么会出现较多的红色物质，是因为没有清洗干净吗？7 w7 J3 J4 H6 h) [2 i6 g/ q6 x
望各位前辈赐教！谢谢！

cm11011

1.我想问下你用什么方法取的脂肪，脂肪组织的单位为什么是ml？
2 t9 F  \( Y" t9 U: W; X2.你的胶原酶终浓度是0.2%？个人意见0.1%就够了，0.2%太强了。酶和脂肪组织的体积比>2：1为佳。
. X8 @5 {* @- g% f/ u- R7 b9 z3.离心3000转对细胞损害比较大，建议你转速调低点，1000-2000转，离心时间可长一些，5-10分钟。8 ?- O. t4 K8 L4 c
4.PBS清洗1-3次就够了，但是消化前最好将肉眼可见血管剪除，这样离心后沉淀里血管内皮和红细胞就少，不会那么红。

可怜的孩子

学习了，谢谢

duoduo777001

回复 2# cm11011
" I+ H9 \* b% r/ F( T- b7 C4 g2 }
$ \1 V: e7 Q" }; j
+ w$ L7 p9 T4 `2 ~- N$ J    你给的一件很受用，非常感谢% b5 [9 ]/ i) G9 i4 O; \& J
我们是直接从手术病人身上提取的脂肪，马上拿回实验室提取。单位是ml

yuheng

1.如果是从人体内抽提的脂肪，没有必要再用剪刀剪了，因为已经是乳糜微粒状。
+ ~* X" q) K. O& T! W2.胶原酶可以是0.15~0.2%，与脂肪（离心弃下层水溶液的纯脂肪）1：1.6 K! r6 v5 m( S' c8 Y+ t/ \" c. `3 `
3.离心转速1800g就可以。
. R8 G( T4 k4 ~8 a+ G$ y4.红色物质是因为脂肪中红细胞太多，如果红细胞过多建议裂红。3 e9 B8 n; Y0 N/ o. c! x
1 I7 l$ D' n" S. M) J& W5 P
以上是自己重复了n次的成功经验，值得借鉴。

duoduo777001

回复 5# yuheng * o- A2 F3 c9 l
非常感谢！

ww2869

感谢了

xiaogongji

我用的是0.1%胶原酶，但是消化下来的不贴壁，为什么？换成一次性瓶子还是不贴壁，郁闷，我是交大医学院的学生，qq:290036556，养脂肪干细胞，还是没出来，请各位高手，给予指导，非常感谢，电话：15091057632，电子邮件：jiwenchenbaoyan@163.com

sunflower636

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- ]) \! C5 v+ E版主是离心后弃去上层纯脂肪留然后重悬下面的沉淀吧？