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下面是我们做实验时的基本步骤:
4 N z& a; D! A0 b8 ?' o0 i% z L1、取人脂肪100ml
6 X, u" B, e* X2 D% G2、配制collagenase solution 80ml(0.16g)
4 \* \2 Z9 t7 H f7 u R3、用1Xpbs清洗脂肪,剪碎,等体积加入collagenase:脂肪=1:1
9 m1 i3 C9 X( ~5 [( z4、37摄氏度,水浴,溶解脂肪0 M( ?6 K6 v4 R4 `
5、过滤,加入到等体积的DMED(10%PBS 1%P/S)
0 m$ C z/ C4 ?6、3000转,3分钟,离心。取上层液与沉淀物分管继续加DMEM离心,同样转速和时间。共三次 L0 s6 d! t: D
7、最后一次离心后取出,可见有红色物质沉淀于最底部,红色物质上为薄薄一层白色薄膜样物质,最上层培养液。
3 S7 H. W4 y; X; u( c8、吸取白色薄膜层后,用DMEM于培养皿中培养。. |3 y, y7 z, f/ z1 h
% y* |. F- c( U7 G2 R8 {( z3 X想请教一下,这些步骤有哪里是错误的,有哪里是操作时要十分注意的?
* C% l( I) y# m) ^; [问题:1、剪碎的脂肪应该与等体积的collagenase相混合吗?8 l6 b1 a$ P Q* a( N- j
2、溶解脂肪时,应该用时多少?如果根据脂肪的多少来算,是怎么样的一个比例$ z2 v, C- C: o$ h3 b
3、离心的时间有没有问题?- q2 u# J9 f: B8 v) O
4、清洗脂肪时,需要清洗几次,到什么样的一个程度为宜?
( ]& t. c6 @" x9 O 5、最后为什么会出现较多的红色物质,是因为没有清洗干净吗?
5 o; x1 b! _& y& Z& h( m望各位前辈赐教!谢谢! |
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