关于脂肪干细胞实验的几点疑问

duoduo777001

下面是我们做实验时的基本步骤：
4 N  z& a; D! A0 b8 ?' o0 i% z  L1、取人脂肪100ml
6 X, u" B, e* X2 D% G2、配制collagenase solution 80ml(0.16g)
4 \* \2 Z9 t7 H  f7 u  R3、用1Xpbs清洗脂肪，剪碎，等体积加入collagenase：脂肪=1：1
9 m1 i3 C9 X( ~5 [( z4、37摄氏度，水浴，溶解脂肪0 M( ?6 K6 v4 R4 `
5、过滤，加入到等体积的DMED（10%PBS 1%P/S）
0 m$ C  z/ C4 ?6、3000转，3分钟，离心。取上层液与沉淀物分管继续加DMEM离心，同样转速和时间。共三次  L0 s6 d! t: D
7、最后一次离心后取出，可见有红色物质沉淀于最底部，红色物质上为薄薄一层白色薄膜样物质，最上层培养液。
3 S7 H. W4 y; X; u( c8、吸取白色薄膜层后，用DMEM于培养皿中培养。. |3 y, y7 z, f/ z1 h

% y* |. F- c( U7 G2 R8 {( z3 X想请教一下，这些步骤有哪里是错误的，有哪里是操作时要十分注意的？
* C% l( I) y# m) ^; [问题：1、剪碎的脂肪应该与等体积的collagenase相混合吗？8 l6 b1 a$ P  Q* a( N- j
      2、溶解脂肪时，应该用时多少？如果根据脂肪的多少来算，是怎么样的一个比例$ z2 v, C- C: o$ h3 b
      3、离心的时间有没有问题？- q2 u# J9 f: B8 v) O
      4、清洗脂肪时，需要清洗几次，到什么样的一个程度为宜？
( ]& t. c6 @" x9 O      5、最后为什么会出现较多的红色物质，是因为没有清洗干净吗？
5 o; x1 b! _& y& Z& h( m望各位前辈赐教！谢谢！

cm11011

1.我想问下你用什么方法取的脂肪，脂肪组织的单位为什么是ml？, M3 t# I$ O* X% _; f1 q9 S2 ~
2.你的胶原酶终浓度是0.2%？个人意见0.1%就够了，0.2%太强了。酶和脂肪组织的体积比>2：1为佳。
9 ~% }: ]( E4 C, B/ A$ A, [5 }3.离心3000转对细胞损害比较大，建议你转速调低点，1000-2000转，离心时间可长一些，5-10分钟。
9 K% w2 p4 S+ V- c3 X4.PBS清洗1-3次就够了，但是消化前最好将肉眼可见血管剪除，这样离心后沉淀里血管内皮和红细胞就少，不会那么红。

可怜的孩子

学习了，谢谢

duoduo777001

回复 2# cm11011 ) B$ P- w  @9 |% c. o+ Z  J# @8 {

. \% Z- V3 ~" ?. S. \# z" A* ?% W/ @4 H$ C
    你给的一件很受用，非常感谢$ v" o7 G% C% P: a0 K; ~, J) H
我们是直接从手术病人身上提取的脂肪，马上拿回实验室提取。单位是ml

yuheng

1.如果是从人体内抽提的脂肪，没有必要再用剪刀剪了，因为已经是乳糜微粒状。5 ~3 e( q4 Z; t6 A0 _$ X$ d
2.胶原酶可以是0.15~0.2%，与脂肪（离心弃下层水溶液的纯脂肪）1：1.( X' ]/ L8 h7 I+ Z
3.离心转速1800g就可以。
: k% S1 `. ]& k3 V+ t3 ?4.红色物质是因为脂肪中红细胞太多，如果红细胞过多建议裂红。! [: e5 y) p8 y: P4 N2 N

+ x- V  V" i+ d8 A以上是自己重复了n次的成功经验，值得借鉴。

duoduo777001

回复 5# yuheng ! w! E! ~8 h2 T8 V( e
非常感谢！

ww2869

感谢了

xiaogongji

我用的是0.1%胶原酶，但是消化下来的不贴壁，为什么？换成一次性瓶子还是不贴壁，郁闷，我是交大医学院的学生，qq:290036556，养脂肪干细胞，还是没出来，请各位高手，给予指导，非常感谢，电话：15091057632，电子邮件：jiwenchenbaoyan@163.com

sunflower636

回复 yuheng 的帖子1 l, c* r7 _3 _! j! l# {0 ?

7 ^3 t8 I( v  K/ b8 V  J0 c: ~版主是离心后弃去上层纯脂肪留然后重悬下面的沉淀吧？