关于外周血干细胞分离实验几点疑问

duoduo777001

以下是我们在做外周血干细胞分离时候步骤，但实验效果不理想，望赐教！谢谢
4 X9 e# z/ V2 }) ^! R1、取兔血30ml，平均分装在三个试管里。
- Q/ e% u9 b0 q1 x% w+ C2、取3个新试管，分别加入10ml的histopaque（1007+—0.001）
3 n4 j/ C' m1 c1 @1 D8 g3、离心，400xg 1h. A( v4 D, W  ]" |: w6 a7 \* L' b( A
4、离心后出现4层，提取出白色薄膜层。
/ w" f# I: J7 f) k, b% {, D5、像提取的薄膜中加入5ml 1xpbs2 i6 x0 q7 |( V4 C$ U
6、250xg 10min 离心1 X* A7 ~7 G+ P
7、弃上清后加入3ml 1xpbs，离心，250xg 10min（重复2次）, `1 Z7 Y9 `# b6 C
8、弃上清后，加入0.5ml1xpbs吹打，转移至dish中，最后再向培养皿中加入1.5ml的DMEM培养液（10%FBS 1%p/s），再于培养箱中培养。
# I$ _3 `7 x+ D+ j2 u* F+ P+ [9 ?
9 \1 _# ]* R# ]) L9 w问题：1、在这个实验加入hispaque之前没有加入与血液等体积的PBS溶液，请问这个溶液加与不加都可以吗？
' j0 b2 K. _' @  w% V      2、取白膜是十分困难，每次离心后看到的白膜基本处于透明色，且非常薄，十分不易提取，有没有什么好的办法可以建议一下，或者说实验步骤上有哪里需要改进。
$ D4 D- W# S5 U$ \! |. \      3、对于第一次离心的时间上应该如何把握，与血液的量有什么样的关系，如果有，是怎么样的比例。3 R% d' K8 a/ M; }7 q& N7 p
谢谢赐教！

yuheng

没用过histopaque，但用ficoll分的时候必须要先用PBS稀释血液。
1 j% H& N) }' |1 z" T4 R白膜少极可能与离心有关，建议离心时关闭brack。ficoll方法分离时采用2300g*30min。. t' W7 Y* K  R- p3 Z9 i9 {
另外不要摇晃离心后的管子，防止破坏白膜