|
- 积分
- 201
- 威望
- 201
- 包包
- 139
|
本帖最后由 细胞海洋 于 2010-4-13 19:43 编辑
0 F3 N' ]$ G) @
8 Y8 M) N3 u) L# H4 j前段时间做的脂肪干细胞现在需要做免疫荧光实验。第一次做的时候没有成功，现在做的是先只加荧光剂进行试验，也就是说不加抗体。以下是步骤，有哪些地方需要改进的，希望前辈们指点一下。# z# F# `6 Q; l8 V
1.去除培养的贴壁细胞进行计数，并转移到新的dish（6well）在培养箱中过夜。
, S- d$ [; L1 N+ }$ K5 ]2.取出细胞，用1*PBS清洗2次，1ml/well，加入3.5%的paraformaldehyde，1ml/well，RT 30min。
6 i3 g$ _( i4 ^1 o$ x. [3.用PBS清洗2次，每次间隔15min
1 N$ n7 j0 P2 g) \4.加入0.1%Tritonx-100 1ml/well RT 10min.
: ? n7 H2 F* c5.用PBS清洗2次。加入DAPI 10min RT5 @) g) n6 M) a7 ^1 g. W" Q% D
6.再用PBS清洗2次，于荧光显微镜下观察。
- h1 _* N, _5 o; \/ s z V B7 n5 g7 e; H- n- B
以上步骤中，有几点疑问：
: C' C- g4 c2 F& J6 ]4 y1.直接做荧光，每次添加试剂后应该用PBS清洗几次。
8 G, s! S' ]6 Z; z; Q5 C' `2.每种试剂的时间应该是多久。
1 ]& G* s6 M( S: ~. k o- j9 m: T; w# c6 B$ Q4 a5 f6 [7 g
/ ~, ]( H: s: r) i
以下是上一次加入抗体时的实验步骤，其中有何不当之处望指点。（本次试验失败了）7 j. Z7 d' f3 c# ^
1.将细胞计数后转移到新的24well上，培养箱中过夜。- h3 V; h2 U! p s
2.PBS清洗2次，加入3.5%PFA300ul/well，RT 20~30min
b7 T& _; y2 A1 y- h% J3.去除PFA，PBS清洗3次，加入0.1%Triton 15min RT) _: m, C6 w9 F
4.PBS清洗3次，加1%BSA 1h RT( O) H. o& M. W" T1 k1 U$ a
5.PBS清洗3次，加1抗（CD29），4℃过夜% w5 W. u& u* z" G3 k. @
6.用PBS清洗3次，加2抗（与BSA混合），RT 2h（避光摇晃）
$ Y% _& m, l c0 F7.PBS清洗3次，加DAPI300ng/ml，5~10min
% j% Y: R% d' ^8.PBS清洗3次，荧光显微镜下观察。
2 m. I+ [! Y4 j1 S* N- r# h, L5 M8 c1 y
以上两个实验步骤望前辈们指导一下需要改进的地方。谢谢！& D/ D, B; s& D2 ?% a2 U/ u$ K& P5 c
) p& n& m3 W9 C& U1 U) K' f4楼是刚到荧光显微镜下拍下的图片 |
-
总评分: 威望 + 20
包包 + 30
查看全部评分
|
发表于 2010-4-13 13:00
发表于 2010-4-13 20:59
