(最新）嵌合抗CD20Fab’抗体片段诱导Raji 细胞的凋亡机制

我是鱼

【摘要】目的探讨嵌合抗CD20抗体Fab’片段的抗肿瘤机制。方法应用MTT法检测Fab’片段对Raji细胞生长的抑制作用，用Annexin V-FITC和PI测定Fab’片段对Raji细胞凋亡的诱导作用，用RT-PCR和Western blot检测Raji细胞中bcl-2表达的变化。结果嵌合抗CD20Fab’片段对Raji细胞具有明显的抑制作用IC50值为24.2 µg/ml，并呈剂量依赖性；嵌合抗CD20Fab’片段能诱导Raji细胞的凋亡，并降低Raji细胞中bcl-2基因及其蛋白的表达水平。结论嵌合抗CD20抗体片段Fab’能抑制Raji细胞生长和诱导细胞凋亡，其作用机制与bcl-2蛋白表达的下降有关。: B/ ]& d. G3 N' J, ]! M! b

5 ^% x+ B: A3 L: E0 p【关键词】抗CD20抗体 B淋巴瘤 Bcl-2
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7 \; @. D4 a6 m/ e: Z【中图分类号】R318 R733* Y$ w3 `1 m# w3 {
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CD20对B淋巴细胞的分化增殖具有调节作用[ 1 ] 。CD20是治疗B淋巴细胞瘤的理想靶点。CD20在前B细胞及成熟B细胞中有表达，而浆细胞、造血干细胞及T细胞则无CD20的表达；CD20比较暴露不为其它表面分子所掩盖，易与抗体结合；CD20和抗CD20抗体结合后不发生内吞作用，因而细胞表面CD20数量并不因为抗体的结合而减少；在人体血清中无游离的CD20存在；最重要的是B淋巴细胞瘤上的CD20少有内吞和脱落的发生[ 2-5 ] 。1997年，以CD20为靶点的嵌合抗CD20单克隆抗体Rituxan已获准应用于B细胞淋巴瘤的治疗[ 6 ]。HI47（IgG3）是我所于1990年研制成功的国内第一个抗CD20鼠源性单克窿抗体，第四届国际人类白细胞分化抗原会议将HI47命名为CD20+X[ 7 ] 。我们利用噬菌体显示技术从HI47杂交瘤细胞中克隆到抗CD20抗体HI47可变区基因，将该基因构建成为嵌合的抗CD20抗体Fab’片段，并在大肠杆菌中高效可溶性分泌表达[ 8 ] ，本研究的目的在于研究嵌合抗CD20Fab’片段的抗肿瘤活性及其作用机制。/ P7 d6 E8 s# _9 b
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一、材料和方法! x  I. g' I, ~6 @( b+ x4 a. ?( [2 A
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1、材料% U4 ?. Q  m/ [( M. e
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MTT购自Sigma公司；Annexin-V为宝灵曼公司试剂盒；TRIZOL RNA提取试剂盒为美国Gibco公司产品；兔抗人bcl-2单克隆抗体和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG为北京中山生物技术有限公司产品，嵌合抗CD20Fab’片段为我室表达并纯化。β-actin引物（上游：5-TCATGTTTGAGACCTTCAA-3，下游：5-GTCTTT GCGGATGTCCACG-3）和bcl-2引物（上游：5-CGACGACTTCTCCCGCCGCTACCGC-3，下游：5-CCGCATGCTGGGGCCGTACAGTT$ \1 v4 l+ t' [9 u0 [8 o1 f0 y  {
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2、方法7 Z0 [2 R' n0 U  G! Z, k
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（1）细胞培养及实验分组: r6 q% N+ b. H, s- z6 D
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人B淋巴瘤细胞株Raji细胞为我室所存，细胞生长于RPMI1640培养基中，含15%灭活小牛血清，37℃，5%，CO2潮湿环境中培养。将处于对数生长期的Raji细胞稀释成5ⅹ105/ml，加入嵌合抗CD20Fab’片段至一定浓度，继续培养一定时间后，进行各种指标测定。
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（2）MTT法测定肿瘤细胞生长抑制作用: a* N$ E; K3 e) }5 u' a# W
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将处于对数生长期的Raji细胞稀释并按每孔2ⅹ104个细胞接种于96孔细胞培养板中，然后加入不同浓度的Fab’片段溶液，每组3个孔，置37℃，5%CO2环境中培养72 h。实验终止前4h每孔加入新鲜配置的MTT 磷酸缓冲液20 µl，继续培养4 h后将96孔板离心，弃掉上清，每孔加入DMSO 200 µl，然后振荡摇匀，于酶标仪测定各孔吸光度值。6 d4 U2 R3 Q  |- T" ?
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（3）Annexin-V染色试剂盒检测细胞凋亡0 y" B, I; E6 q4 G
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采用宝灵曼试剂盒，按照说明书操作进行。
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5 X/ K' }/ w; g! f（4）RT-PCR分析bcl-2基因的表达9 f6 S# P, G+ p

# o" U1 F3 J$ u7 J0 V" u: U/ N- a按照TRIZOL RNA提取试剂盒说明书提取细胞总RNA，RT-PCR试剂盒进行逆转录和PCR扩增反应。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，紫外灯下观察并拍照，β-actin为内参照。
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$ q# ^6 l4 Q. C* F（5）Western blots 测定细胞bcl-2蛋白的表达
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) o  o/ w# o+ ~- K5 I3 p% ARaji细胞经细胞裂解液裂解后，经Folin-酚法测定蛋白浓度，调整蛋白浓度至等量上样，经SDS-PAGE电泳后，转移到硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉4℃ 封闭过夜，室温下与兔抗人bcl-2单克隆抗体反应1.5 h，辣根过氧化物酶标记的二抗反应1.5 h，充分洗膜，用发光试剂盒显色并拍照。
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0 ~; u: z4 ^  I, Q; c1 h0 F二、结果
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9 F5 U  f5 ^0 X8 x: t+ g1、MTT法测定结果
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& z$ \2 V# W2 `, H3 S为了检验嵌合抗CD20Fab’片段对Raji细胞，的生长抑制作用，以PBS为阴性对照，用MTT法测定Fab’片段对Raji细胞生长的影响，其结果显示，Fab’片段对Raji细胞具有抑制作用，其抑制作用具有明显的剂量依赖性，其半数抑制量为（24.2±7.8） µg/ml。$ f3 M- `8 ], ^6 q4 S% F9 H
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表1嵌合抗体CD20 Fab’片段对Raji细胞的生长抑制率
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Tab 1 The inhibition rate of Raji cells by the anti-CD20 chimeric fragment Fab’
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Fab’（µg/ml） Inhibition rate（%）
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6.25                   31.0±5.6
* \$ h% ^, K1 i3 t2 _; B/ C7 D% H
# @. ^9 r, a$ Z+ S$ c$ h12.5                   37.0±5.31 I& z% \* W  g7 i0 o4 y1 V
5 d+ M" Z/ A# ?# g6 j
25                      42.7±8.0  u2 C; [& H0 e7 O. t+ J6 o
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50                      57.7±8.56 Y- [% J% j6 e8 f6 l
6 ~% N& ^, \0 z) g( h! K8 V
100                    71.2±10.8
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6 W) y) e% C  @3 O" `' iData shown are mean ± SD of triplicate determination. Control is PBS.
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& o# Y9 H' e3 t* `# N2、AnnexinV-FITC染色流式细胞术分析
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在流式分析图上，左下区细胞簇为活细胞，表现为FITC及PI均低染（FITC- PI- ）；右下区细胞簇为凋亡细胞，表现为FITC高染而PI低染（FITC+ PI-）；右上区细胞簇为坏死细胞，表现为FITC和PI均高染（FITC+ PI+）。我们以非相关抗体HIT3a （CD3）为阴性对照（9%），结果表明，嵌合抗体Fab’与Raji细胞作用24h和48h后，其细胞凋亡率分别为16%和21%。4 @- Q; _- V$ j4 U" }0 g
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3、嵌合抗CD20Fab’片段对bcl-2表达的影响6 Y7 o8 u  @( Q6 j5 s, m/ A  o1 i+ a2 |
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为了进一步探讨细胞凋亡过程中所发生的分子机制， 用RT-PCR 和Western blot分析嵌合抗CD20Fab’片断对Raji 细胞中bcl-2表达的影响。结果显示，Raji细胞经过Fab’片段24h、48h、和72h不同时间的孵育后，bcl-2在mRNA和蛋白水平均明显降低。
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三、讨论
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抗体抗肿瘤的机制主要有抗体依赖的细胞毒作用（ADCC），补体依赖的细胞毒作用（CDCC），诱导肿瘤细胞凋亡，此外有的抗体还能阻碍肿瘤细胞中配体与受体的相互作用，抑制肿瘤细胞关键蛋白的表达及其活性，提高肿瘤细胞的药敏性，诱导抗独特型抗体系统以及抗体与其连接的毒素、同位素或化疗药的杀伤作用相联合等机制。抗CD20抗体作为单独的治疗剂治疗B淋巴细胞瘤，主要是通过ADCC、CDCC及诱导肿瘤细胞凋亡等作用机制来杀伤肿瘤细胞的。不同的抗CD20抗体由于结合的抗原表位不同，可引起不同的生物效应，例如，IF5可激活B淋巴细胞， C2B8却对B淋巴细胞的生长具有抑制作用[ 9-10 ]。和完整抗体相比，嵌合抗CD20抗体HI47Fab’由于没有Fc段，不能产生ADCC和CDCC，但是Fab’分子量较小，肿瘤穿透力极强，且能在大肠杆菌中表达，在肿瘤治疗中具有潜在的应用前景。1 U1 W" X; S9 y: v0 d6 D7 g) L

( Z' b/ D7 _' \0 P0 a6 @细胞增殖和细胞凋亡之间失去平衡，导致过多细胞增殖而较少细胞凋亡，则发生肿瘤。细胞凋亡的研究为肿瘤防治提供了新靶点和新思路，不少化疗药物都是通过诱导和增强肿瘤细胞凋亡，从而发挥治疗肿瘤的作用。试验研究表明，嵌合抗CD20抗体Fab’片段能够直接抑制肿瘤细胞的生长，并可诱导B淋巴细胞的凋亡，这说明单价抗体不仅有抗原的结合能力，应用于显像或偶联，还具有直接抗肿瘤作用。抗CD20Fab’片段与细胞作用后可明显观察到细胞凋亡是所发生的的形态学特征和生化标志，如，核染色质密度增高并凝聚在核膜周边，细胞器完整且有胞膜包裹的凋亡小体，以及在琼脂糖凝胶电泳中呈现特征性的180-200bp大小整数倍的DNA梯形条带（另文发表）。
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在凋亡早期，细胞膜的改变之一是磷酯酰丝氨酸从胞膜内层转移到胞膜外层，Annexun V是一种Ca2＋依赖性的磷脂结合蛋白，它与磷酯酰丝氨酸有高度亲和力，因此，该蛋白可以作为一种敏感探针，用于检测早期凋亡细胞。由于坏死细胞失去膜的完整性磷酯酰丝氨酸也会暴露，故必须加入另一种染料（如碘化丙啶），以便从Annexin V-FITC染色阳性细胞群中区别出坏死细胞。bcl-2基因是从人B淋巴细胞瘤中分离出来的一种抑癌基因，bcl-2基因及其蛋白可以抑制多种组织的细胞凋亡，延长细胞的生存期，许多癌细胞由于bcl-2的高表达而对射线或多种化疗药物耐受。许多因素可调节bcl-2 mRNA或bcl-2蛋白的水平，如某些抗癌药物在诱导细胞凋亡的同时伴有bcl-2基因表达的下降，本文的结果证实了嵌合抗CD20Fab’片段在诱导Raji细胞凋亡的同时也伴有bcl-2基因表达的下降，初步证明了嵌合抗CD20抗体Fab’片段对Raji细胞作用机制可能是通过直接或间接地影响到该细胞的bcl-2的表达或功能，进而抑制细胞生长，诱导细胞凋亡，最终得以有效地挟制和杀灭肿瘤，这为抗体可用于联合化疗或降低病人耐药的临床治疗提供了有力的证据。* p2 b; A/ O/ u" P, k9 z0 w

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平沙落雁

谢谢了