科学家完成 CRISPR-Cas13a 介导的精确定点 RNA 编辑的人工机器

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科学家完成 CRISPR-Cas13a 介导的精确定点 RNA 编辑的人工机器: t* V. s( ~( J* ]% E( v/ P
上海生命科学研究院 / 2018-06-21
* ]; W/ W* n* T5 月 31 日，国际学术期刊 Nucleic Acids Research 在线发表了中国科学院分子植物科学卓越创新中心 / 植物生理生态研究所李轩研究组合作完成的题为 Implementation of the CRISPR-Cas13a system in fission yeast and its repurposing for precise RNA editing 的研究论文。该工作报道了一个利用新发现 CRISPR 家族中的 Cas13 蛋白（VI 型）及其指导 RNA(guide RNA)靶向结合特异序列单链 RNA 的能力，通过设计改造并与人源的 RNA 脱氨酶催化结构域（hADAR2d）结合，实现了精确定点 RNA（A→I）编辑的人工机器。与近年来利用 CRISPR 家族蛋白（例如 Cas9）对 DNA 编辑来修改基因 / 调控基因表达不同，Cas13 体系不涉及编码基因 DNA 的改变，而是通过对基因转录产物（mRNA）进行编辑，为改变基因功能和调控表达提供了新的方法和思路。
) L: u9 g6 r9 n+ M5 g: Q# T近年来利用 CRISPR 技术对生物物种基因 DNA 的编辑（包括切割和碱基替换），获得了巨大的成功，同时也面临技术上的限制。与 DNA 编辑技术互补，一个针对 RNA 的精确定点编辑技术，有独特的技术优势和应用。与 DNA 编辑技术相比，RNA 的定点编辑不改变编码基因本身（DNA 碱基改变后不能逆转），在时间上、空间上和效率上更加可控。同时，RNA 编辑可以同时修改多个基因、同时靶向多拷贝基因的所有转录产物（尤其是对多倍体的物种），所以更加高效。在对疾病的基因治疗领域，利用 RNA 定点编辑修复疾病组织的突变基因，有着重要的应用价值。: G* B' F# R1 o4 t. T, ?7 B9 v
为了实现精确定点 RNA 编辑的人工机器，李轩研究组与研究员杨晟、中科院上海巴斯德研究所研究员郝沛及美国密歇根大学教授王红兵合作，对新发现 CRISPR 家族中具有结合特异序列单链 RNA 能力的 Cas13a，首先在模式生物裂殖酵母（S pombe）中实现了其靶向内源 RNA 和降解靶标 RNA 的功能。进一步，设计  利用 Cas13a 的改造产物 dCas13a（丧失 RNA 切割活性的突变），将 dCas13a 与人源的 RNA 腺嘌呤脱氨酶催化结构域（hADAR2d）融合，引入到裂殖酵母中；再通过设计 RNA 编辑机器的靶向“零件”指导 RNA，实现了对内源 RNA 的精确定点编辑。为了对 RNA 定点编辑机器的设计和参数（编辑碱基位置、距离、指导 RNA 结构和长度等）进行优化，研究人员构建了一系列不同的设计，并利用一个双荧光报告（reporter）系统来测试不同设置的编辑效率，从而获得了精准 RNA 编辑机器的最优参数。优化后的编辑机器对内源靶标 RNA 的编辑效率达到了 59%。最后，该研究实现的精准 RNA 编辑机器的功能，进一步体现在对裂殖酵母反转录转座子 Tf1 突变株的修复和操作的实验中。Tf1 与动物细胞的逆转录病毒类似，其跳跃和扩增需要经过中间体 RNA 的逆转录步骤。研究人员利用精准 RNA 编辑，恢复了 Tf1 突变株的转座能力，这个应用对逆转录病毒干预和操作提供了一个有潜力的工具。0 K" F9 _8 T$ s! E! f! }/ c
该研究主要由荆新云和解冰冉等人完成。相关工作得到了中国农业部项目、国家科技重大专项和自然科学基金项目的支持。
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