我国李亦学课题组和杨辉课题组揭示胞嘧啶碱基编辑器诱导大量的单位点脱靶突变

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Science：我国李亦学课题组和杨辉课题组揭示胞嘧啶碱基编辑器诱导大量的单位点脱靶突变5 }, t# Q0 s& {2 ]' m" V- h) I' d
来源：本站原创 2019-03-02 21:07* S6 m( z" M& f% k7 s
2019年3月2日讯/生物谷BIOON/---基因组编辑在治疗由致命性突变引起的遗传疾病上有很大的潜力。对基因组编辑的脱靶效应进行全面分析是验证这种编辑实用性所必需的。科学家们已开发出多种方法来检测全基因组范围内的基因编辑脱靶位点。然而，这些方法并不适用于检测体内的单核苷酸变异（SNV）。
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在一项新的研究中，中国科学院的李亦学（Yixue Li）课题组、杨辉（Hui Yang）课题组和美国斯坦福大学的Lars M. Steinmetz课题组开发出一种称为GOTI（genome-wide off-target analysis by two-cell embryo injection, 利用双细胞胚胎注射进行全基因组脱靶分析）的方法来评估三种经常使用的基因编辑工具---CRISPR/Cas9、胞嘧啶碱基编辑器3（BE3, rAPOBEC1-nCas9-UGI）、腺嘌呤碱基编辑器7.10（ABE7.10, TadA-TadA*-nCas9）---诱导的脱靶效应。简言之，这些研究人员将CRISPR/Cas9、BE3或ABE7.10与Cre mRNA一起注射到源自Ai9（CAG-LoxP-Stop-LoxP-tdTomato）小鼠的双细胞胚胎的卵裂球中。在胚胎期第14.5天（ED14.5）时，基于tdTomato的表达，利用荧光活化细胞分选方法（FACS）对经过编辑的卵裂球和未经过编辑的卵裂球的后代细胞进行分选。与此同时，在ED14.5时，整个胚胎也很容易经消化后获得足够的单细胞。他们随后对tdTomato阳性细胞和tdTomato阴性细胞单独地进行全基因组测序（WGS）。以来自相同胚胎的tdTomato阴性样本作为对照，利用三种算法对来自相同胚胎的tdTomato阳性样本中的SNV和indel（insertion or deletion, 插入或删除）进行研究。2 o, L3 m- W- ^- y, H

8 _$ s# ]# ]0 o& g" [图片来自Science, 2019, doi:10.1126/science.aav9973。
2 G" |! G2 |$ J* a' [: N: D在这项新的研究中，这些研究人员包括了12个组：一个Cre组（Cre-only, 仅注射Cre）、6个具有或不具有单向导RNA（sgRNA）的Cas9组（Cas9、Cas9-LacZ、Cas9-Pde6b、Cas9-Tyr-A、Cas9-Tyr-B和Cas9-Tyr-C）、三个具有或不具有sgRNA的BE3组（BE3、BE3-Tyr-C和BE3-Tyr-D）和两个具有或不具有sgRNA的ABE组（ABE7.10和ABE7.10-Tyr-E）。首先，他们通过桑格测序（Sanger sequencing）在胚胎8细胞和ED14.5时验证了他们的方法在胚胎中的在靶效率。为了进一步探究在靶效率和潜在的全基因组脱靶效应，他们对来自ED14.5胚胎的46个样本进行全基因组测序，并证实Cas9、BE3和ABE7.10在tdTomato阳性细胞中高效地诱导indel和核苷酸替换。
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+ `% m' K: B% p# Z* ?, {! s5 H7 K对在靶编辑效应而言，这些研究人员在来自这12组的胚胎中仅发现0～4个indel，而且没有一个indel与预测的脱靶位点发生重叠。对所有经过Cas9处理的胚胎而言，与Cre-only组（平均每个胚胎存在14个SNV）相比，不同的Cas9组（平均每个胚胎存在12个SNV）不存在显著的差异。在发育期间，在经过Cre或Cas9处理的样本中检测到的SNV可能是由基因组复制期间的自发性突变导致的。
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, U  D7 z- [% k' X( B令人吃惊的是，这些研究人员在经过BE3处理的胚胎中，发现了平均每个胚胎存在283个SNV，这一水平至少要比在经过Cre或Cas9处理的胚胎中观察到的高出20倍。相反之下，在经过ABE7.10处理的胚胎中，平均每个胚胎存在10个SNV，这一频率接近于自发性突变率。他们进一步地将在BE3-only组（即仅注射BE3的组）中鉴定出的脱靶位点与在BE3-Tyr-C组或BE3-Tyr-D组中鉴定出的脱靶位点进行了比较，并发现sgRNA的存在并不诱导显著高的SNV（P=0.21，Kruskal-Wallis test）。此外，这些变异是在tdTomato阳性细胞而不是在tdTomato阴性细胞中特异地鉴定出的。) U! c6 q3 a; F; S6 {
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令人关注的是，在经过BE3编辑的细胞中鉴定出的90%以上的SNV是G>A或C>T，这一突变偏好并没有在经过Cre、Cas9或ABE7.10处理的细胞中观察到。这一突变偏好与APOBEC1本身的突变偏好相同，这表明这些突变并不是自发的而是由BE3编辑诱导的。之前的研究已表明APOBEC家族的几个成员（包括APOBEC1）发挥作用需要单链DNA。与此相一致的是，这些研究人员的分析表明由BE3诱导的SNV在转录区域中显著富集，特别是在高度表达的基因中。有趣的是，这些脱靶位点中的任何一个并不与经过BE3处理的胚胎中观察到的相同，而且也不与预测的脱靶突变发生重叠。此外，也并未在脱靶序列和靶序列之间观察到相似性，然而，预测的排名靠前的脱靶位点与BE3的在靶位点存在着较高的序列相似性。因此，BE3引起的脱靶SNV并不依赖于sgRNA并且可能是由APOBEC1过度表达导致的。
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在经过BE3处理的胚胎中观察到的1698个SNV中，26个SNV位于外显子中，其中的14个导致非同义变化。这些研究人员成功地将通过PCR扩增了其中的20个SNV并通过桑格测序证实了它们的存在。他们还发现1个SNV位于一个原癌基因中，13个SNV位于肿瘤抑制基因中，这就让人对BE3编辑的致癌风险感到担忧。这种风险可能通过表达较低数量的BE3加以降低。然而，他们发现当表达较低数量的BE3时，在靶效率逐渐降低。/ c8 e5 |8 [4 F; G' T0 W* c$ a

" j. p  y/ Y2 c" b2 J6 P令人关注的是，这些研究人员发现大量新生突变是由BE3诱导的，这一点在之前的研究中并未报道过。一种可能的解释就是GOTI研究了源自单个经过基因编辑的卵裂球的细胞群体，而之前的研究使用了大量的细胞群体，在那里，编辑是可变的，而且由于细胞群体平均化，这会导致随机的脱靶信号丢失。不同于BE3的是，ABE7.10并不导致SNV数量增加，这很可能是缺乏TadA的DNA结合能力。这些碱基编辑器的脱靶效应可能通过降低APOBEC1的DNA结合能力或者使用不同的胞苷脱氨酶版本来加以降低。总之，GOTI可用于研究多种基因编辑工具的脱靶效应，而且不受在不同个体中存在的单核苷酸多态性（SNP）的干扰。（生物谷 Bioon.com）
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参考资料：- g+ c! o) ^# H3 ~" X5 c

# @7 s2 _. k$ L! W, GErwei Zuo et al. Cytosine base editor generates substantial off-target single-nucleotide variants in mouse embryos. Science, 2019, doi:10.1126/science.aav9973.
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