胡家志课题组开发出优化基因编辑和追踪 DNA 修复的新方

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胡家志课题组开发出优化基因编辑和追踪 DNA 修复的新方
4 |. d# I9 n0 M% R6 `  K& z6 _+ t来源： 生命科学联合中心 / 作者： 胡家志 / 时间： 2019-03-27
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4 q" {, R) j( \2019 年 3 月 26 号，北京大学生命科学学院和北大 - 清华生命科学联合中心胡家志课题组在 Cell Discovery 上发表题为 Optimizing genome editing strategy by primer-extension-mediated sequencing 的论文。该研究描述了一种新的方法，可以用来同时定量检测 Cas9 编辑效率和脱靶活性以及编辑引起的染色体异常结构，即 primer-extension-mediated sequencing（PEM-seq）。这是对基因编辑和 DNA 损伤修复等领域都有巨大促进作用的新技术。/ `1 q  F' w9 n! J, |( f+ Y
CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats and CRISPR-associated proteins) 是目前最常用的基因编辑工具酶，在科研领域被广泛应用，而在临床方面的应用因为其脱靶活性一度停滞不前。它通过 guide RNA（gRNA）与靶向 DNA 序列的配对，从而将 Cas9 锚定在靶向基因并诱导产生 DNA 双链断裂（DSB）。在基因编辑诱发的 DSB 的修复过程中，一定几率会产生基因突变或者外源 DNA 片段的插入，从而达到基因编辑的目的。在实际应用过程中，一个好的基因编辑酶 Cas9 需要同时满足高效切割靶位点、低脱靶活性和低染色体异常三个特点。目前在这三个方面，有一部分基于 PCR 的方法用于估算基因编辑效率，但其结果可靠性有待提高；有一些基于高通量测序的方法可以在体内或者体外检测基因编辑酶的脱靶活性；尚无系统的可定量的测量基因组异常结构的方法。
& v" z! z# P( l. b‌依据 DNA 双链断裂与染色体易位的原理，胡家志课题组在已有的高通量测序方法 (Hu et al., Nature Protocols 2016) 的基础上开发了灵敏度更高且可以全面且定量评估基因编辑的新方法 PEM-seq。与以往基于二代测序评估 Cas9 脱靶活性的方法相比，PEM-seq 不仅可以灵敏的找出 Cas9 的脱靶位点，还可以精确定量 CRISPR/Cas9 在靶向位点的切割效率，从而找到更加高效安全的 Cas9 切割位点。与此同时，PEM-seq 还深度揭示了靶向位点附近由于基因编辑而产生的染色体异常结构，例如大片段缺失、染色体易位等。以靶向治疗 RAG1 基因上的 RAG1A 编辑位点为例，胡家志课题组发现：在 Cas9 切割位点 5kb 以内存在着占总编辑事件 2.5% 的大量的染色体缺失倒位等异常结构；更为严重的是，这些异常结构可以延伸至距离切割位点 50kb 甚至更长的领域，足以严重威胁基因组的稳定性。这些现象揭示了 Cas9 应用前评估的必要性。应用 PEM-seq 可以全面地评估 Cas9 的切割效率及其所导致的大多异常结构，从而优化基因编辑策略，以达到获得最大编辑效率且尽量减少脱靶活性的效果。  {; [* v8 x, M# q* |: j0 t% i
PEM-seq 检测出 Cas9 在 RAG1A 位点有 53 个脱靶位点
( i, p$ E+ Y8 U' m" xPEM-seq 检测到在 Cas9 切割位点 5kb 内存在着大量染色体异常机构3 H( c! E5 a; q; m+ N: W
同时，为了降低 CRISPR/Cas9 的脱靶活性，胡家志课题组将现有 Cas9 变体的突变位点进行了组合筛选，通过 PEM-seq 筛选出了一个切割效率与野生型 Cas9 相当但脱靶频率明显更低的变体 FeCas9。该酶的使用方法与传统 Cas9 类似。3 x% z; J8 i5 X( n0 |
此外，PEM-seq 在基因组的稳定性研究方面还有较大的潜力。基因组的修复与 DNA 修复等因素密切相关，而传统的方法多用 PCR 或者分子克隆获得修复。
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