外泌体提取的7种方法及其优缺点

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外泌体提取的7种方法及其优缺点
3 R$ @* C; y  q0 L$ P6 s/ N, p7 Y; N来源：流式中文网 2019-04-01 17:26
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1、差速离心
& j- J7 I+ X6 O! T! e7 f9 H差速离心仍然是最常见的外泌体分离技术之一。 该方法包括几个步骤，包括1）低速离心去除细胞和凋亡碎片，2）更高速离心以消除更大的囊泡，最后，3）高速离心沉淀外泌体：
/ D0 }! A1 W7 O+ }不过需要注意的是，样本的粘度与分离的外泌体纯度有显着的相关性，因此，具有高粘度的生物样品（例如血浆和血清样本）需要更长的超速离心步骤和更高的离心速度。
* g6 i+ K5 R7 w/ E6 ?7 _/ b$ Q9 l步骤： 以300×g离心10分钟，取上清。 以2000×g离心10分钟，取上清。 10，000×g离心30分钟，取上清。 100，000×g，在4℃下持续离心90分钟，去掉上清，留下的沉淀PBS重悬后，再次以100，000×g离心90分钟。9 ]! q' i- u+ m) A: D# d
2、密度梯度离心
# o5 `8 \; r/ `; P/ b该方法将超速离心与蔗糖密度梯度相结合，实现外泌体与非囊泡颗粒分离，例如蛋白质和蛋白质/RNA聚集体。 因此，该方法将囊泡与不同密度的颗粒分开，能够提取含量低的外泌体。 但是，合适的离心时间非常重要，否则如果它们具有相似的密度，则仍可在外泌体中发现污染颗粒。 2018年Li K等人改良了此方案，回收率更高、纯度更高，并且结构和功能保持更好（Li K， Wong D， Hong K， Raffai R. Cushioned-Density Gradient Ultracentrifugation (C-DGUC)： A Refined and High Performance Method for the Isolation， Characterization， and Use of Exosomes. Methods Mol Biol. 2018；1740：69-83[1]）
3 A: k' K# J. j: M- N# w+ f! J3、尺寸排阻色谱
5 Y/ z% Y1 p' C: ?$ [$ w+ g尺寸排阻色谱（Size-exclusion chromatography，SEC）是基于大小而非分子量实现分离大分子。 该技术应用填充多孔聚合物微球的柱子，分子根据其直径通过微球，半径小的分子需要更长的时间才能通过色谱柱的孔隙迁移，而大分子则从色谱柱中更早地洗脱。 尺寸排阻色谱可以精确分离大小分子。 此外，可以将不同的洗脱溶液应用于该方法。 与离心方法相比，色谱分离已被证明具有更多优势，因为通过色谱分离的外泌体不受剪切力的影响，这可能会改变囊泡的结构。 目前，SEC是一种广泛接受的分离血液和尿液中外泌体的技术。 不过，该方法耗时较长，不适合大量样本处理。
& w* L! i' g& X3 \1 _3 D: T4、过滤9 z) K. Z: y* w! a) i+ f
超滤膜也可用于分离外泌体。根据外泌体的大小，从蛋白质和其他大分子中分离外泌体。 最常见的过滤膜具有0.8μm、0.45μm或0.22μm的孔径，可用于收集大于800nm、400nm或200nm的外泌体，也有设计成微柱多孔硅纤毛结构以分离40-100nm外泌体：
4 b- U$ `7 h" W" ^8 n不过，该方法由于过滤膜的粘附，可能会损失外泌体，并且过滤时的压力和剪切力，可能会使外泌体变形受损。. f2 z8 O5 I0 d/ L( @
5、基于聚合物的沉淀技术
* s/ f" S3 w7 x& j4 _# B基于聚合物的沉淀技术通常包括将样本与含聚合物的沉淀溶液混合，在4℃温育并低速离心。用于聚合物沉淀的最常见聚合物之一是聚乙二醇（PEG）。用这种聚合物沉淀具有许多优点，包括对分离的外泌体影响小、pH中性等。目前大多数快速分离外泌体的商品化试剂盒都是基于此方法。 然而基于聚合物的沉淀方法可能会同时分离非囊泡污染物（包括脂蛋白）而且，聚合物材料的混杂可能会影响下游分析。
2 R- E& g7 v3 G8 m2 ^2 v2 B6、免疫分离技术) L3 c' J) v1 ?4 k7 `) W
免疫分离外泌体的原理大多是通过抗体包被的微球，特异性结合外泌体。 例如使用抗肿瘤相关HER2和EpCAM的抗体从肿瘤细胞中分离出肿瘤来源的外泌体。 然而，使用抗体包被珠子的分离不适合从大量样本中获得外泌体。, {' D) z. n+ e/ a; _2 w
还有将抗体包被于ELISA中的那种板上面，直接分离后检测、分析、定量。最近的一项研究已应用免疫亲和超顺磁性纳米粒子（ISPN）来结合外泌体，研究人员通过连接抗CD63抗体和纳米粒子生成ISPN，并用它们从体液中分离外泌体。8 @& Y3 g* [, M! V: y2 q
7、通过筛分分离7 o9 n% @; s* s" H2 c
该技术利用压力或电场，通过膜从样本中筛出外泌体：& [3 C! B$ H: {) O( f* g# `3 @
该方法分离时间短，可以提供较高纯度的外泌体。 但是回收率低。(生物谷Bioon.com）  Q1 j& w, G, J3 @* S