科研求助!--(!)

kqyy

小弟是用人骨髓培养人的骨髓间充质干细胞的,效果很差.我取2-4毫升骨髓枸椽酸盐抗凝,种到25平方厘米的玻璃瓶中,48-72小时初次换液时几乎什么都没有.
7 [4 ?7 W' r0 a$ p      问题一:抗凝剂枸椽酸盐损伤细胞,导致细胞活力受损.' h% j3 E3 T6 ?1 Y6 Y
     问题二:运输保存，我用一个泡沫保温盒子，里面没有加冰，估计里面的温度２０几度吧．
* N9 I& H5 R. D+ Q* {/ ^　　问题三：抽取的骨髓液太少，种的面积太大．２－４毫升种２５平方厘米的玻璃瓶．
' h2 ?5 `' X2 D4 t4 h　问题四：血清浓度问题．我一直用ＤＭＥＭ＋进口１０％ｆｂｓ，有人建议我用１５％的血清，我曾经有一批用２０％的血清养出来了。
$ k3 t  j# R  c/ M% Y　问题五：培养箱的原因。我一直在一个培养相养。里面肿瘤细胞和各种原代细胞都有人养，另外培养相的各种参数是否正确等。

宝贝一家亲

对于抗凝剂的影响我不太清楚/ N/ p$ e4 C- g
但是我可以给你后面几个问题 提出我的看法  希望对你有帮助' W/ T! O1 y( o, V
运输保存最好是在冰上 而且最好拿到以后最短的时间里分离出细胞进行培养
7 q" I( R7 P, _% x, Y培基可以尝试提高血清至15%，另外我们一般养原代会添加非必需氨基酸 我不知道你们的培基里是否需要添加
; y6 V* t0 S- S  ]) F: t: r% T还有是否需要添加其他因子
) X- z5 t: O8 Z2 u. l: j' X7 I接种细胞密度也很关键 合适的密度 * q6 O# `" M6 v5 ~: _% K
太稀的话细胞很难长起来 9 Z- n  w6 p9 S4 T9 D, m
培养箱的话如果其他细胞培养都没有问题那么培养箱就没有问题

tnfsf10

回复 2# 宝贝一家亲 ( `. G2 r1 a- ?" H5 N. i

3 i7 k6 M" V5 Y/ W6 L' j7 |" \1 p1 Z
    1.抗凝剂最好使用肝素钠抗凝。（12500U肝素钠/100ml生理盐水溶解）与骨髓1：1
& `' `. U2 F* w( s7 `( D2.原代培养时候，骨髓分离出来的单个核细胞，一般建议2*10 5次方/cm2接种，24到48小时半量换液。一般来说，MCS贴壁很快的，不需要24小时。如果看到的很少，可能是MCS很少。我观察的48小时后可以明显看到纤维状细胞，换液的上清使用新的培养瓶培养，基本没有纤维状细胞出现。
% b9 q* P4 ]% V. ^: J9 I9 y3.我现在的问题也是，原代细胞生长缓慢，不知道有没有好的方法加快细胞分裂。我没有添加生长因子的。/ \& q1 I! Y" y7 I+ K" y
希望和大家一起学习！

烂桃

放置时间长会有影响，我做的首次半换液72h，原代的可以用15%FBS，我个人认为BMSC还是比较好养，抽出后时间长的话可以肝素钠抗凝，时间段就不需要，加培养液稀释离心，重悬接种后三天后半换液，在两三天全换液，差不多一个星期到十天左右就能长满，不过前几天最好不要经常拿出来看，会对细胞贴壁有影响，我一般前三天都不动它的

烂桃

2-3ml骨髓，主要用全骨髓贴壁，密度梯度离心也用过，但是形态不如全骨髓的好，10 8次方首次接种的话10cm的培养皿2×106\个，原代培养我有时加一些生长因子

5784630

回复 5# 烂桃 ! C# D, c8 D5 n; d5 Z/ q
1 y( C8 a, K( E, J' s) Q

+ g, {4 U: E' r% P5 d1 ]    楼上，你好，能给我发一份全骨髓贴壁法的protocol吗？  H, T& M- H3 E
   我的QQ:1005139063% m, e0 k7 w. u' ?0 O  O
    非常感谢

kqyy

请问版主"烂桃"的疑问:
! f! w, B0 b) k% v1、关于抽取骨髓的体积的问题，多少毫升种多大的瓶。多大的密度种什么瓶。( K6 w8 y3 E2 G* S" L9 B
2、培养基稀释是完全培养基还是基础培养基呢？