科研求助!--(!)

kqyy

小弟是用人骨髓培养人的骨髓间充质干细胞的,效果很差.我取2-4毫升骨髓枸椽酸盐抗凝,种到25平方厘米的玻璃瓶中,48-72小时初次换液时几乎什么都没有.
6 z8 h( f8 Z8 D, r9 K2 p' X      问题一:抗凝剂枸椽酸盐损伤细胞,导致细胞活力受损.8 G+ Y1 X  `4 F0 n$ M5 [- g! }
     问题二:运输保存，我用一个泡沫保温盒子，里面没有加冰，估计里面的温度２０几度吧．" y- W6 R5 [8 j* T' M( q
　　问题三：抽取的骨髓液太少，种的面积太大．２－４毫升种２５平方厘米的玻璃瓶．+ L2 ?# P/ N5 E& u# c
　问题四：血清浓度问题．我一直用ＤＭＥＭ＋进口１０％ｆｂｓ，有人建议我用１５％的血清，我曾经有一批用２０％的血清养出来了。
7 ]. g4 ^# g( ^0 i5 j　问题五：培养箱的原因。我一直在一个培养相养。里面肿瘤细胞和各种原代细胞都有人养，另外培养相的各种参数是否正确等。

宝贝一家亲

对于抗凝剂的影响我不太清楚1 V" F& p: T2 W! |9 G( f) }! T1 ]
但是我可以给你后面几个问题 提出我的看法  希望对你有帮助$ N% W$ g$ C; w( I1 T2 Z5 }
运输保存最好是在冰上 而且最好拿到以后最短的时间里分离出细胞进行培养
5 h2 F/ i& ]! K9 i# [4 p  v培基可以尝试提高血清至15%，另外我们一般养原代会添加非必需氨基酸 我不知道你们的培基里是否需要添加 7 O& r0 s6 W$ v, z
还有是否需要添加其他因子
7 l7 M$ @  K& C( z! D接种细胞密度也很关键 合适的密度 / D3 w/ ]% P2 f) j$ ]6 b
太稀的话细胞很难长起来 7 s, Y! u+ Q/ X
培养箱的话如果其他细胞培养都没有问题那么培养箱就没有问题

tnfsf10

回复 2# 宝贝一家亲
7 n& B5 V2 B& N( o0 |: E1 K6 b) n7 g. }8 X4 J: e& w9 G/ `$ \
* e/ ^3 v7 ^# o
    1.抗凝剂最好使用肝素钠抗凝。（12500U肝素钠/100ml生理盐水溶解）与骨髓1：1& u- D" e& K: u, Z+ P7 F% l8 W0 y' a
2.原代培养时候，骨髓分离出来的单个核细胞，一般建议2*10 5次方/cm2接种，24到48小时半量换液。一般来说，MCS贴壁很快的，不需要24小时。如果看到的很少，可能是MCS很少。我观察的48小时后可以明显看到纤维状细胞，换液的上清使用新的培养瓶培养，基本没有纤维状细胞出现。
) Q* d$ o6 D2 D' X; ~; x8 C3.我现在的问题也是，原代细胞生长缓慢，不知道有没有好的方法加快细胞分裂。我没有添加生长因子的。2 q* Z. J4 N( f: `- O& Q8 s; `% W9 w
希望和大家一起学习！

烂桃

放置时间长会有影响，我做的首次半换液72h，原代的可以用15%FBS，我个人认为BMSC还是比较好养，抽出后时间长的话可以肝素钠抗凝，时间段就不需要，加培养液稀释离心，重悬接种后三天后半换液，在两三天全换液，差不多一个星期到十天左右就能长满，不过前几天最好不要经常拿出来看，会对细胞贴壁有影响，我一般前三天都不动它的

烂桃

2-3ml骨髓，主要用全骨髓贴壁，密度梯度离心也用过，但是形态不如全骨髓的好，10 8次方首次接种的话10cm的培养皿2×106\个，原代培养我有时加一些生长因子

5784630

回复 5# 烂桃
6 \& Y  m- h6 H0 |. X2 M+ F. G5 J1 ?8 G8 K( n

5 s1 P& S+ n) c5 Z    楼上，你好，能给我发一份全骨髓贴壁法的protocol吗？5 }/ \& o7 ], d
   我的QQ:1005139063; F6 O" n# F) S
    非常感谢

kqyy

请问版主"烂桃"的疑问:* e4 S! U/ p( T% O' @/ k
1、关于抽取骨髓的体积的问题，多少毫升种多大的瓶。多大的密度种什么瓶。, V' D) {8 x- E" X' v
2、培养基稀释是完全培养基还是基础培养基呢？