小鼠BMSC原代细胞贴壁太紧！！求助~~

why121

回复 19# angel-sakura
8 H; k  H# A6 a) Q/ m" P- j/ q8 x2 w7 o2 |& y7 G+ ]8 W& M
1 S) d5 E9 b+ f+ B5 S0 h
    我前几次做的也是不断的传代 但形态和流式检测都不算MSC 想请教下楼主的胰酶浓度和消化时间以及鼠源的选择等 有什么特别需要注意的地方吗？我这个图里有MSC吗 郁闷

angel-sakura

回复 21# why121
9 ?; k8 Y. K9 T" b" }6 n# }6 `) j
2 _; z; ^& a# p" J: V/ T" ~; a
- a/ t$ J9 ^% A( N) L; S- W你的情况貌似和我出现的一模一样啊。。。胰酶浓度为0.25%消化时间为2min，你用的小鼠年龄是？？我的原因出在小鼠年龄过大。最好用胎鼠，鼠源的话我记不清了，不是我负责的。

why121

回复 22# angel-sakura
# k  L, y6 x. J! L6 t* D$ s9 s5 m( ?% n/ ?
2 H1 Z# V' E+ k. l. R' j: c
    我用的是BALB/C2-4周的雄性鼠 现在根据本论坛的一篇文献换成6-8周的呢 准备试下 您是用密度梯度的方法吗》？能介绍下具体的操作吗？比例是1：1还是什么的？

lchanlon

对的，间充质干细胞一般比较容易消化的，我的间充质干细胞是从公司里购买的，复苏后一般生长3天就可以达到80-90%,便可以进行传代培养了。我都是用0.05%的胰酶消化，消化1分钟，细胞就会完全脱落，然后，轻轻拍打，再吹几下就可了。楼主，这样的细胞状态就开始传代，是不是有点儿早啊。细胞也就50%左右吧。可以换一下液，然后再培养几天后开始传代培养。我做的小鼠骨髓间充质细胞还是很容易消化的。

angel-sakura

回复 23# why121
# D5 R  V! Y2 m# Q. A+ E$ i' L  g% n/ m# F. s

; d, h) A2 t2 f    我用的是全骨髓法，因为要尽量保持它的分化能力

wsrz

回复  get0715
1 n2 U$ \9 B: b我消化的时候是放到培养箱中孵育的，我是第一次做BMSC的原代，操作上确实可能有问题，而且 ...$ A/ s8 o* C- y; c- n4 e
angel-sakura 发表于 2010-4-27 22:05

8 j' Q/ L7 O% P% b; ^4 _) h
6 n4 o1 E, X  p" k  o- R. [

$ s' G8 H# @9 U+ R    我觉得长满时间5-10天都行，不一定非要求一个准确的时间。5天长满不见得就不好

wsrz

/ c6 Q0 S& k: m5 z% _

回复  小熊不杀生
, k2 D# J0 I! X, F5 H9 v我经过多次消化后发现有许多细胞仍贴壁，并且多次消化后细胞的增长速度越来越慢，细胞形 ..., |# p( L7 c- ], d. s
angel-sakura 发表于 2010-8-18 11:55

+ U3 a9 b, L+ d
1 I) e' m( C% d. V5 t
/ h" f4 ~! |8 a# d- k6 L    LZ，你说传到另一个培养皿中算一代，而不是胰酶消化一次算一代，我就想问，传到另一个皿中之前肯定要用胰酶消化后才能传啊，那不就还是胰酶消化后传一代。或者你的意思是你在传到另一个培养皿之前，用胰酶消化过很多次？另外，你是如何解决细胞老化这个棘手的问题的呢？我养的大鼠细胞很容易就老化，就像你说的细胞内结构都不清楚了，形态也不好。

kqyy

我的建议:9 H) N' `1 Q! {  N
1:消化体系问题:酶和edta的量和质量。& H0 \' v+ @* H! D- z/ f: Q
2：消化时处理：务必吸干净废液，酶要复温。
) D; O8 A2 V( y$ Q3：镜下观察消化程度。

angel-sakura

回复 27# wsrz
, k8 n& ]' W3 U% n# Y5 P因为容易把代数弄错的地方在冻存方面，即防止复苏后出现代数混乱的情况，所以认为认定传到皿中后才算一代，这个是按个人习惯来的。
; N6 m, y1 a: j: I# Z8 a9 T8 u选胎鼠的话可能会好些，不过我做的不是大鼠，不知道情况会不会相似，此外，操作也可能造成老化。

wsrz

, D: M1 ~0 o5 @% P
, ]  @& G! T$ n! b; _
回复 29# angel-sakura   y' k7 E- E. w/ J$ u. P

8 G, I- a% z) l& f* J! p/ i: N6 p+ f5 e' d4 E) Z. m, z; w5 z
    谢谢你的回复，我明白你的意思了，冻存、复苏的确容易弄混代数呵呵。