请教大家：关于显微注射

cony

本人的任务主要是通过ES介导制备转基因老鼠。大致为将外源基因导入ES细胞，再奖ES细胞注入blastocyst，然后移植，大家认为用何种方法转染ES细胞效率高些？还有谁做过ES的microinjection?如做过烦请将要注意的地方及要点说一说，大家分享一下？因为本实验室以前没做过这个，开始比较难搞。。。。谢谢大家

sunhongying

我没做过

toxin

小鼠ES我们原来做时候用的电转。显微注射如果囊胚的质量好还是比较好做的，还有注射的针尖大小要合适，和ES细胞直径差不多就可以。注射用的细胞消化要好一点，宁愿细胞稀一点，不要杂质多。我们一般每个囊胚注射9-15个ES细胞，这个要看你的ES细胞的克隆形成率。以上是个人的一点经验，不过你的题目太空的，不知道该给你什么建议。

jayhaoli01

用何种方法转染ES细胞效率高些---如上所说，电转效率高！
! O7 y4 f# \  P如果要做嵌合体，实际上四细胞、八细胞的效率和嵌合效果要好于囊胚，但技术难度大（不借助PI和XY的话），如果是新手建议还是用囊胚吧！再有就是细胞处理有步骤，要不容易粘针，再有针要处理干净还要加工好，粗细大小，针尖，斜口角度都要考虑等等，仅供参考

polato

cony是要做KOmouse？

polato

本人的任务主要是通过ES介导制备转基因老鼠。大致为将外源基因导入ES细胞，再奖ES细胞注入blastocyst，然后 ...; D$ C1 H+ a* Q6 q
cony 发表于 2010-4-29 19:58

) S5 v# A7 J6 k/ S9 I$ s+ \
lZ这个问题问的很混乱，之间没有任何逻辑！
* b7 |" a/ b, X) p: `$ k1 S; Y0 X其一，首先楼主没有分清楚transgenic mouse和knockout mouse的概念，内部混乱！
; d( W9 g& x8 e5 u& d& [: {所谓转基因mouse是把外源基因导入到老鼠内体，采用的是原核注射的方法，这个和将ES注入blastocyst简直有本质区别
- s0 v' b" m% v8 j而Knockout mouse是将要研究的目的基因敲出掉，获得敲出掉的ES细胞系，然后再将其注入blastocyst，获得KO mouse

cony

回复 3# toxin + X  p: B* Y6 p
多谢你的建议，现在注射是自己做的，大概10ul左右，也就跟ES细胞差不多，那看来我首先要尝试电转了。

cony

回复 5# polato 0 g" J3 N% F- Y% E  i2 c
  l2 j3 K9 |6 Y/ Z' I/ x
: {- e" r8 J  H$ {
    不是，transgenic mouse

cony

回复 6# polato * p( f+ M9 W, q+ [
转基因老鼠除了原核注射，还有另外一种方法，就是通过嵌合体进行回交，进而产生转基因动物。而嵌合体来源之一就是能过供体ES细胞与受体鼠囊胚的嵌合。不知我是否有说错，不吝赐教。。谢谢

cony

回复 4# jayhaoli01 ( R# `: b- t( F: N
老板的课题是要通过三种途径来做转基因老鼠，第一，ES细胞与囊胚嵌合；第二，与孤雌发育而来的囊胚嵌合；第三，四倍体融合，通过这三个途径所得囊胚移植产生嵌合体，回交，即是要通过生殖系传递来产生转基因动物。