关于小鼠胚胎干细胞传代后不贴壁问题

quduck

最近复苏了2批细胞，刚刚复苏的效果比较好，3天-4天传代后发现培养基里面漂浮了好多团块样细胞，考虑是干细胞克隆，只有很少量的干细胞克隆贴壁生长，边界比较清楚，没有明显分化迹象。$ v( P. q. B" c2 V1 x" X; _0 a
有谁知道为什么传代后的不贴壁生长的细胞有这么多，是我没有吹打得很散的原因，还是这些悬浮的细胞已经分化了呢？这样我损失了好多干细胞，明显影响了实验进度呢，呜呜。

周会

请问你接种feeder之前包被了明胶吗
; o7 r/ [" t" v还有就是即使你消化时没有吹得很散，克隆体也不会悬浮，还是会贴壁的8 w- z( H1 E1 e) u; Y! F; @
所以还是从feeder的状态和培养条件的原因着手吧，祝你好运！

细胞海洋

建议上传图片 无图无真相

jiejesse

是不是你消化过度了呀？

hygene

严重支持楼上超级版主“无图无真相”

xjya

一可能是feeder细胞准备的不好.
0 [" Z1 J  F( M6 d' T1 R二可能是消化过度,传代的时候镜下看看细胞,只要有大量细胞脱离培养皿就可以终止消化了, 若是用的0.05%trypsin，一般2min就够了, I3 v( t& J/ n) ~( @
三是可能你计数不准确，太多的细胞会影响其生长。一般500000 cell/6cm培养皿，加5ml含LIF（1000IU/ml)的培养基。干细胞不怕吹的，新手还是要制成均匀的细胞悬液后，准确计数后reseed cells。$ j1 w1 m' w3 h+ i. H& x" M
祝你好运！

大猪小猪落玉盘

1.改用进口培养瓶0 d$ R1 r' K0 u$ V& s" z; g* e
2.国产要铺明胶) y" y+ Y% i& k" S8 A  @8 h
3.可能污染，但可能性不大

quduck

用的进口培养皿，肯定是用明胶铺板过的，不过正如xjya所说，这次消化的时间长了点，不过我是用0.25%胰酶消化20s后吸出多余，用残留在皿底的胰酶继续消化约5分钟后再中止的。显微镜下看起来也没觉得太过了。饲养层出问题的可能性也比较小。

ruoxiangxi

消化的时间过久吗还是你加入的胰酶量过多了，导致细胞产生变化，

痞子的烟头

我认为可能引入支原体污染，当然前提是确保你所有试剂在保质期内，你的CLONE是不是长的很慢，而且传代前几天细胞状态及形态都非常不好，大概在五天左右细胞克隆才相对好点，同时还有大量悬浮的小团块细胞，建议你加入支原体抗生素；