小鼠胚胎干细胞原代培养

zhbshi998

请教各位：小鼠胚胎干细胞原代培养的具体操作过程，尤其是胚胎干细胞挑取过程，用什么器材，具体怎样操作好啊！谢谢！

cony

这个你最好找研究生毕业论文认真看看。。一下子也说得不太具体。。大致就是3.5d囊胚的获取，将其接于MEF饲养层，等其ICM孵化后，机械挑出再接于另一MEF，第二天应该贴壁了，再消化下来按ES细胞培养传代。饲养层方面要做好，四代以内MEF，丝裂酶处理才能用于接胚胎

zhbshi998

可以推荐一下具体的论文吗？我自己不大会找，谢谢

cony

你那不能上中国期刊网吗？就去那里找啊。我只能授之以渔了。

leestone

可以參考一下) q4 H) c$ |. g: T& h4 n6 |  }. ~# u

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zhbshi998

谢谢

懵懂干细胞

我也正在找这个文献呢。谢谢分享哦！

jsy

挑克隆时06年nature protocol 中使用枪头，不过我个人觉得在体视镜下使用口吸管挑取更方便。不过也有说法是口吸管对细胞的伤害较大。

jsy

从配鼠到得到可扩增细胞约24~30天，首先挑自然发情的老鼠合笼，等3.5天后冲取囊胚，直接接种在已准备好的饲养层上。之后两天不要动，因为这时是囊胚贴壁的时候。第三天，可以计算贴壁率，换新鲜培养液。接种后第五天、第六天即可挑取outgrowth。不过具体挑取时间可根据不同的胚胎适当调整。将克隆置于胰酶滴中，我用的是0.25%的浓度，置于37度处理5分钟后用20微升的枪头吹打，以吹散细胞。

jsy

对了，有一个细节，protocol上是将胰酶消化物直接接到血清的ES培养基中，第二天再换成KOSR的培养基。是为了用血清终止消化，再更换培养液是为了防止血清诱导细胞分化。
- H; T& Y1 X3 U* n" F, J* N我采用的是用同等体积的FBS的ES去终止胰酶消化，然后将其全部转移到KOSR的培养基中。我的想法是尽可能减少fbs对细胞的影响。具体如何操作，看你觉得哪个有理，再权衡斟酌。