求助：中脑神经干细胞的培养方法和技巧

dingyx2009

按照文献说的培养几次都不成功，种植细胞密度也不少，但四天后几乎全部死亡。

get0715

取材时保持低温，放在冰块上；另外就是培养基的成分和pH的问题了。
7 j- f& p1 o9 A" R  K4 d% y! `' z需要你说一下试验的具体情况，才能有的放矢的解决问题。

huangzhenbo131

这个影响的因素太多了，你的取材，实验的操作，培养基的成分，培养的方法等等都可能影响神经干细胞的存活。这里没有你做的具体的protocol，大家也很难找原因。不过我建议你参照文献时，最好是找权威可信，而且要全面一点的，不要随便拿到一片文献就照着做，因为有些文献的方法它写的不是很具体，你缺少某些因素时就可能重复不出它的实验结果。关于神干的培养论坛里有一些很好的资料，你可以参考参考。
& o  G+ P, m, f% R+ Y2 c, D( p. uhttp://www.stemcell8.cn/viewthre ... m%2Bcells%2Bmethods

dingyx2009

谢谢你的指导。我培养海马神经干细胞很成功。用同样的方法做中脑的神经干细胞就养不好。具体的流程和试剂如下：7 \5 U1 u+ G9 ]1 J3 D4 b
无血清条件培养基：DF12+B27(2%)+BFGF20ng/ml＋EGF20ng/ml$ b* B% q0 C: w
取材时取腹侧中脑组织，收集所有的组织，剪碎，0.25%的胰酶消化20－25分钟，立即用含10％FCS培养液终止消化5分钟，离心，漂洗1－2次，加入无血清条件培养基吹打组织15次，静止3－5分钟，取上清，重复以上操作一次，收集两次的单细胞悬液，计数，种植。另外不知大家的细胞密度是多少？我用1x105/cm2（每瓶5ml）,观察总觉得细胞少，状态不好。

dingyx2009

回复 2# get0715
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- `+ }  l. c# k" Y我操作是在冰袋上进行的，试剂也应该问题不大，别人用来培养其它部位的干细胞也没问题。我也看了有的文献是不确实与中脑部位的干细胞比较少有关。如何调整才能养好啊？谢谢

dingyx2009

回复 3# huangzhenbo131
2 F) H0 R3 O9 A6 o1 c& t8 C! W2 ~2 l5 ^* U. r+ G5 }! F
谢谢指点可惜我权限不够，我没法看到你提到的资料啊。着急

huangzhenbo131

回复 2# get0715 9 J) b5 l! G2 i1 Y! |% B3 W1 W6 u2 ]% x* R, r3 e
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: F- ]3 N, }7 j' @; E/ r  C9 u! H3 a我操作是在冰袋上进行的，试剂也应该问题不大，别人用来培养其它部位的干细胞也没问题。我也看了有的文献是不确实与中脑部位的干细胞比较少有关。如何调整才能养好啊？谢谢

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看了一下你的操作，基本上没什么大问题。这可能确实是与中脑部位的干细胞比较少有关。你的取材应该是刚出生的或是胚胎时期的小鼠或大鼠吧。我的建议是你可以将取材时间提前一点，比如说E18.5，E16.5。当然太早可能脑组织太小，不好分离。我的意思是早一点取材，中脑部位的干细胞可能会更多一点。另外你可以调整一下胰酶的消化条件，比如说浓度和时间。因为这对神干的活性有一定影响。

get0715

回复 4# dingyx2009   R- g: i2 |0 i
: @' H7 j8 k  |2 |! c9 K) N% Y
我没有分离过中脑的神经干细胞，所以对中脑的组织不是太了解。是不是多数的脑组织都不会太硬，如果用胰酶消化很容易对细胞的活性产生影响，本来不多的神经干细胞这样消化又洗又离心的，不但丢失多，而且伤害很大。如果可以直接用机械法分离，过细胞筛除去多余的组织，我个人建议你可以试一下，而且原代的接种浓度一定不能太少，1*106为宜。

dingyx2009

回复 7# huangzhenbo131
, r: D' I1 }( r0 i# K4 O: U9 K% V% u# n; K4 X/ p7 _, T
回复huangzhenbo131:! {5 M& K& T* r( W: R/ T
我是用新生一周的小鼠。看来是应该考虑换胚鼠了，外分感谢！另外，你们常用胰酶的浓度和时间是多少？

dingyx2009

回复 8# get0715
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9 D, F; u: v% D/ ]8 o/ i( _回复get0715:6 p) O& ~. j+ m3 m! m/ F
谢谢指教，你们用200目的筛网吗？具体怎么操作?呵呵，现在都不敢轻易相信有些文献，上次借用中文文献的一个方法，害的我细胞全军覆没。