求助基因敲除小鼠的相关问题

esc123esc

我现在刚刚开始做基因敲除小鼠，刚开始扩增同源臂，短臂大概2kb多吧，换了好几种酶，很难P出特异性的单一条带，总会有模糊的一片，或者有很多条非特异带，请问高人是不是mESC的基因组都是这样不太好扩呢，难道是基因组本身结构的问题，比体细胞要复杂吗？

可怜的孩子

不知道你的模板怎样获得的。还有你的引物是否设计合适呢？

绿雪

出现模糊的一片或者多条非特异带，可能的原因是引物退火温度太低了，可以提高退火温度试试，或者做个梯度PCR摸索下最适合的条件。
1 w: H/ ~, g% L另外，PCR是有很多影响因素的，模板质量、引物设计、体系比例等都会影响结果的。5 o. }# c( `! Q" w$ @; M4 Y" x
还有一点我不太明白：楼主的模板DNA为什么要用mESC，普通组织细胞就可以了吧？

jcb

search ucsc browser, find the number of Bac clones7 W1 Z0 K  W9 @" J  w  R+ ~
get some  from invitrogen.7 D3 Y9 |9 o1 H1 z$ q. Q
0 R2 u7 n. c- e7 z
or" S+ ]" z5 S) \* b6 {
Try Takara product.* c4 o5 `, l: u6 W% l" d
it is always tricky to get long fragment from genomic DNA.

chleiwu

单从PCR可以换用TAKARA的高特异性酶，另外提高退火温度，多做几个梯度

xiangchou812

楼主用mESC基因组作为模板恐怕是为了避免用其他小鼠的组织的基因组可能有的突变，在小鼠中发现，同源臂的同源性对打靶效率是有影响的。不行的话可以先扩长点（设计合适的引物，把你的目的片段都包括进去），插到载体后再用你的引物来扩增，这样可能会得到你的目的片段。另外，不用管杂带有没有吧，只在有你的目的基因出现，切下来测序鉴定一下看，如果是的话，即使有杂带也不影响你使用呀。

mansnoopy

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引物模板是一方面。但是有些基因结构本身就不好扩   会现成一些多为结构