复旦赵曜团队联合浙大郭国骥团队，利用单细胞测序指导脊索瘤新药临床试验

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《细胞发现》：复旦赵曜团队联合浙大郭国骥团队，利用单细胞测序指导脊索瘤新药临床试验, ^( S7 G  F; v0 P0 z+ t! Z
来源：奇点糕 2022-09-29 16:11
) p3 r6 w# F8 \+ d7 X9 Q4 K# [这个研究首次在单细胞层面发现了颅底脊索瘤中存在的干细胞亚群及p-EMT过程，并在实验室中验证了放疗增敏剂及p-EMT抑制剂的治疗效果。/ M) k5 ?4 r! x/ r7 }6 [0 O  ^: u
颅底脊索瘤（SBC）是一种罕见的、源自斜坡或鞍区脊索残留组织的恶性骨肿瘤，年发病率约每百万人0.1-1例。4 W& [! N3 n  k; H1 P
由于肿瘤位置深，临近重要组织、血管及神经，手术全切难度非常高。即使实施了手术，大约80%的患者术后存在肿瘤残留和复发。由于残留肿瘤对常规放射治疗不敏感，又没有公认有效的药物，这也导致颅底脊索瘤患者往往在经历数次“手术-复发”之后，面临“无药可医”的困境。, Z8 E. z' o+ a
因此，研究颅底脊索瘤的发病机制，寻找治疗靶点迫在眉睫。
+ r; T( h3 v/ o# C4 d: y  C: F4 |近日，国家神经疾病医学中心、复旦大学附属华山医院神经外科赵曜教授团队和浙江大学郭国骥教授团队合作，在著名期刊Cell Discovery杂志在线发表重要研究成果[1]。$ m% t! L% A" z+ U- }, Q
他们利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术，首次在颅底脊索瘤恶性细胞中发现了的一簇干细胞样细胞簇，并且证明这一细胞簇与肿瘤对放疗的抵抗密切相关。
' F9 L6 e1 q$ [$ j0 y- e" s# @此外，这个研究还揭示肿瘤细胞内存在不完全上皮间质转化（p-EMT）过程，而且这一过程与脊索瘤的侵袭性密切相关，可作为预后标志物和治疗新靶点。
. x+ @4 e1 Q# O更重要的是，在上述研究成果的基础上，研究人员开展了I期临床实验，在3名脊索瘤患者中证实服用p-EMT抑制剂（YL-13027）可以显著减缓肿瘤生长，且能保持至少6个月的无进展状态。
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- A# V: ]% H+ @! @论文首页截图4 H+ k/ T' _0 ^: v; J6 ^
颅底脊索瘤对放疗不敏感，低剂量的常规放疗往往难以控制肿瘤生长，但是由于其生长部位临近脑干，导致大剂量放疗往往难以运用于颅底脊索瘤治疗。有部分研究报道了质子重离子照射用于治疗脊索瘤取得不错的效果，但质子重离子治疗价格昂贵，很多患者无法负担。
# j4 J  R+ A' G% Y! c: F0 e因此，研究人员希望发现颅底脊索瘤放疗抵抗的机制，而其中最为可能的便是颅底脊索瘤中存在肿瘤干细胞（CSCs），肿瘤干细胞导致了脊索瘤对放射治疗的不敏感。但是此前的研究并未明确发现CSCs的存在。+ \! B& M9 L: c" R; H
同时，颅底脊索瘤表现出强侵袭性，但是其背后机制尚未完全明确，如果能搞清楚侵袭性机制，可能为颅底脊索瘤提供潜在的治疗靶点。
, w+ y; D3 c- G" s此外，有部分病例报道指出抗PD-1免疫疗法在颅底脊索瘤治疗中取得不错的效果，但是仅局限于极个别病例，并且颅底脊索瘤是否表达PD-1/PD-L1也尚未得到明确。) _2 c$ ^) \/ r- N" ]7 Y! e
因此，为了阐明SBC中CSCs和PD-1/PD-L1表达亚群的存在，并进一步探索细胞的异质性和肿瘤侵袭性的机制，研究人员对SBC进行了单细胞转录组分析。& L  g- K# _$ m! c
研究人员对6名没有接受过放疗的患者的12个颅底脊索瘤样本进行了单细胞转录组测序，共获取90691个细胞的转录组数据。- w/ [, B, @2 m& L6 z4 e
基于测序数据，研究人员将所有细胞划分为10种亚型共17簇细胞。随后，他们运用infer CNV及脊索瘤相关标志物，鉴定出约60000个恶性细胞（即肿瘤细胞）及约30000个非恶性细胞（间质细胞、免疫细胞等）。
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研究过程
+ @! w0 O+ Q( F. b. ^, N/ g* J8 o鉴定出的非恶性细胞主要为免疫细胞及间质细胞。根据经典的标志物，研究人员将间质细胞分为4个亚群，将免疫细胞分为8种细胞共15个亚群。研究人员进一步将颅底脊索瘤中免疫细胞与人类细胞谱图（HCL）中的免疫细胞进行比较，发现部分类型的免疫细胞中PD-L1调控体（例如AXL）的表达升高，提示了PD-1/PD-L1疗法可作为颅底脊索瘤潜在治疗靶点。
6 Q0 `. w1 b4 p肿瘤细胞根据基因表达差异，被进一步划分成六个亚群。所有六个亚群均表达脊索瘤的标志物TBXT（即brachyury），也都高表达间质细胞标志物VIM。此外，研究人员还发现有两个亚群（cluster 5和6）高表达增殖相关标志物。
2 J& A# n6 E: b  o3 N% B* H由于SBC对化疗和放疗的抵抗，研究人员强烈怀疑SBC中存在CSCs。因此，他们利用此前研究总结出的脊索瘤等恶性骨源性肿瘤的干细胞标志物，对颅底脊索瘤肿瘤细胞进行干细胞打分，发现其中一个亚群（cluster 3）在恶性细胞中具有较高的干细胞特征。! A. A% a' g# [" d' H' o
随后研究人员对各个亚群高表达基因进行通路富集分析，也显示cluster 3与细胞增殖分化等干细胞通路显著相关。同时，研究人员也利用单细胞轨迹分析技术（scVelo），发现cluster 3在所有恶性细胞中处于前体地位，所以研究人员初步推定其为颅底脊索瘤肿瘤干细胞簇。[img=415,487]blob:http://www.stemcell8.cn/d0754bae-4703-4f51-9299-2e86d8e04d29[/img]
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- f) P0 |' e# O$ u+ @! wSBC的表达异质性
5 [. i) n' E; j1 w- e为了进一步探索该干细胞簇与脊索瘤放疗抵抗的相关性，研究人员对颅底脊索瘤细胞系进行X光照射，并将照光前后的肿瘤细胞进行RNA-seq分析，利用差异表达基因，共富集出3个模块，其中模块2富集出的端粒末端组装（packaging of the telomere ends）通路中的组织蛋白酶L（Cathepsin L, CTSL），在前述脊索瘤干细胞簇中也高表达。  v( O, k! f  Y
后续的体外实验初步验证了CTSL的抑制剂（Z-FY-CHO）可以显著降低脊索瘤细胞系的放疗抵抗性，提示CTSL可作为颅底脊索瘤放疗增敏剂的潜在靶点。0 |8 i& W) f1 B1 X% G. P
为了进一步探索颅底脊索瘤肿瘤细胞内潜在的生物学过程及其机制，发现潜在的治疗靶点，研究人员利用非负矩阵分解（NMF）对脊索瘤肿瘤细胞进行聚类，发现脊索瘤肿瘤细胞中存在8个模块。随后研究人员根据各个模块的基因表达情况及通路富集情况，分别定义出各个模块所代表的可能的生物学过程，其中之一就是p-EMT过程，这也是首次明确发现脊索瘤中存在p-EMT过程。; l4 h' x1 b: g6 Q( s- v& J2 I: n' H
后续为了进一步验证p-EMT过程的存在及其在脊索瘤中的作用机制，研究人员开展了体外细胞实验和裸鼠成瘤实验，并且对187例颅底脊索瘤患者的临床数据进行回顾性分析。9 f% g% A$ C5 T
体外及裸鼠实验主要针对前述研究发现的TGF-β通路调控的p-EMT过程，研究人员选用了多种TGF-β通路抑制剂，明确了p-EMT与脊索瘤侵袭性的相关性，抑制TGF-β通路可以显著下调脊索瘤中的p-EMT过程，从而抑制脊索瘤的侵袭性。: C% |( X4 c! w
回顾性分析纳入了2010至2018年间在复旦大学附属华山医院神经外科手术的共187例颅底脊索瘤病人，研究人员根据病理组织切片的p-EMT相关标志物的免疫组化染色结果，将187例患者分为高p-EMT组（94例）和低p-EMT组（93例）。两组的基线临床指标没有显著差异，结合随访信息，研究人员发现高p-EMT组的生存时间（OS）及无进展生存期（PFS）均显著低于低p-EMT组，提示p-EMT过程与颅底脊索瘤患者预后显著相关。
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, h. W, G+ k. [$ `& a6 I1 s在前述所选用TGF-β抑制剂中，YL-13027正处于拟开展I期临床试验的阶段。于是，研究人员进一步开展了一项I期、单臂、开放标签的临床试验，探索脊索瘤能否作为YL-13027的适应证之一。
+ y% S- t& u- M% r; u3 ~此次入组的3名颅底脊索瘤患者在服药血药浓度达到稳定后，每隔8周进行磁共振复查。经两位影像科专家独立阅片测量后，明确这三名患者服药后肿瘤生长均得到抑制，相应症状得到缓解，并且保持了至少6个月的无进展状态。此期间患者无明显不良反应。
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/ g6 p0 W8 K. C  c6 Q% U3 V1 F$ V总的来说，这个研究首次在单细胞层面发现了颅底脊索瘤中存在的干细胞亚群及p-EMT过程，并在实验室中验证了放疗增敏剂及p-EMT抑制剂的治疗效果。后续的临床试验则进一步证实了p-EMT抑制剂的临床效果，为脊索瘤的药物研发提供了新的思路，为脊索瘤患者的治疗带来了新的曙光。) Z1 o. m2 k0 Q: `2 g3 k
复旦大学附属华山医院的张启麟医生、韩瑞博士、黄若凡教授、王镛斐教授、陈宏教授，浙江大学费丽江博士为本研究的第一作者；国家神经疾病医学中心、复旦大学附属华山医院神经外科赵曜教授、浙江大学郭国骥教授为本研究的通讯作者。' E* o5 a8 Z. W7 X4 j) l
参考文献：, c4 `, j! A( Q, c/ [' Q
[1].Zhang Q, Fei L, Han R, et al. Single-cell transcriptome reveals cellular hierarchies and guides p-EMT-targeted trial in skull base chordoma. Cell Discov. 2022;8(1):94. Published 2022 Sep 20. doi:10.1038/s41421-022-00459-2
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