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发表于 2009-2-28 08:16 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

多年以来，许多学者一直认为，癌症与衰老是在细胞凋亡（apoptosis）调节机制的控制之下的。最近研究表现，细胞的癌变与衰老主要是受细胞染色体两端的重复序列---端粒（telomree）长度的控制，端粒末端转移酶-端粒酶（telonerase）特异地合成，其长度起着分子钟（molecular clock）的作用。
一、端粒的发现及克隆4 _  Y/ H: w  ?) D( a
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  早在20世纪30年代，两位卓越的遗传学家Muller（诺贝尔奖获得者）和McClintock分别发现细胞染色体末端具有特殊序列，该序列具有维持染色体稳定性的功能（图8-1）。Muller根据希腊文“末端”（telos）和“部分”（meros）,将染色体末端的特殊序列命名为“端粒”（telomere）。McClintock注意到，虽然端粒序列不含功能基因，但是如果没有这些类似染色体的“帽子”（cap）结构的端粒，染色体之间就会出现端
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图8-1  端粒的结构2 K7 Q, Z! N) q7 ^

端粒位于染色体末端，含若干TTAGGG重复序列，附着于核基质，使染色体稳定
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-端融合（end-to-end fusion）、降解（degradation）、重排（rearrangement）和染色体丢失（chromosome loss）等变化，这些变化威胁着染色体的正确复制和细胞的存在，因此，端粒是至关重要的。/ L- k6 ~. F: b- U9 x( `5 b

  直至1972年，Watson（曾因与Crick共同提出DNA双螺旋结构模型而荣获诺贝尔奖）才重新注意到端粒的问题。他发现模板（template）和引物（primer）的存在，而且只能从5`到3`端方面合成。这样，在引物被去除之后，细胞每分裂一次，在新合成的DNA互补链的5`端必将留下一个小空缺（一段端粒）（图8-2）。这就不能解释DNA从头（de novo）合成的问题。这样，细胞染色体长度会越来越短，其稳定性越来越差，直至最终细胞衰亡（senscence）。这对单细胞生物种系的繁衍是致命的，甚至可能导致种的灭绝。然而，事实并非如此。只是连Watson在内的人戊当时还不能解释，包括单细胞生物在内的物种，是如何维持染色体端粒的长度而保存种系的。# f3 v" l1 [7 Z# a- F5 j! u

  Blackburn和Greider等人（1975年）对Watson提出的问题产生了极大的兴趣。他们推测，很可能存在一种完全不同于传统DNA聚合酶，能特异地合成端粒的酶---端粒酶。1978年，他们首先克隆了四膜虫（一种有纤毛的单细胞池糖微生物）的端粒结构：一种串联的线性排列的核酸重复序列---（TTGGG）n。这种线性排列的端粒重复序列的数目是非固定的，端粒限制性片段长度（telomreic restrction fragments length）也不相同的。端粒长度在细胞的对数生长期增加，因此端粒长度是能或增或减的动态变化结构。此后有人对锥虫、酵母、蛙、小鼠和人等多种物生细胞的端粒进行了克隆。Moyzis等（1988年）应用原位杂交方法，发现锥虫的端粒重复序列为TTAGGG，酵母、人和脊椎动物均为（TTAGGG）n。Black-burn根据已经克隆的端粒序列，得出端粒的通用公式为：Cn(A/T)mGn,n=1-8,m=1-4；其中真核细胞的端粒是简单重复的G1-8（T/A）1-4的松散性保守序列，因此端粒是一种富含C的DNA序列。8 Q) U! _, l& x! U$ ]9 h0 W
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二、端粒酶的发现及鉴定+ h" R( `+ v3 D% U% V
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  在端粒及其结构功能研究的基础上，Blackburn与Greider合作，开始寻找端粒酶的研究工作。分们（1985年）首次在四膜虫中发现并鉴定端粒酶的存在：人工合成的四膜虫端粒片段（TTGGGG）4能特异地被四膜虫细甩抽提物中的一种活性物质如长。这种重复片段的增加与内源性DNA聚合酶及α-型内源性DNA聚合酶无关。这种活性物质可被热、蛋白酶K和RNA酶破坏。因此认为，端粒酶由蛋白质和RNA两部分组成。
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  为进一步搞清端粒酶的作用原理，对端粒酶的结构进行了研究。Greider等（1989年）成功地克隆了四膜虫端粒酶的RNA组分的基因：为159个核苷酸，其中包含5`-CAACCCCAA-3`的膜板序列，以碱基互补的方式在3`端从头合成重复片段（GGGGTT）n。Yu等又将四膜虫端粒酶的RNA组分兵模板序列CAACCCCAA进行突变，发现其端粒序列同时也发生相应的突变；这种突变还导致细胞分裂的终止和细胞衰亡，显示正常端料序列及长度是四膜虫细甩内的一个必须因子。
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  Shippen-Lentz(1990年)克隆了游仆虫属的端粒酶RNA序列，其中包括5`-CAAAACCCCAAA-3`模板序列。该模板亦与基端粒重复序列（TTTTGGGG）n以碱基互补方式合成RNA序列。研究还认为，端粒酶RNA中的模板每次与1.5个（TTTTGGGG）重复序列互补，然后通过模板的滑动，再进行下一次合成。
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  Shippen和Gottschling(1994年)鉴定了酿洒酵母的端粒酶RNA基因。如将该基因剔除（knock out）,则引起酵母的端粒以每代3个碱基的速度进行性缩短；将模板序列改变2个碱基，重新导入酵母的端粒酶RNA基因时，端接线片的序列也发生了相应的改变。- g; A6 V- p3 ?( i" S6 y; D
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  许多低等生物中存在端粒酶，那么人的细胞中是否也存在端粒酶？美国加州大学的分子生物学教授Morin（1989年）首次在人宫颈癌细胞株HeLa细胞中发现并鉴定端粒酶存在一种核糖核蛋白质。为进一步探讨人端粒酶的结构和功能，美国Geron公司Feng和纽约长岛冷泉港实验室Greider等（1995年）克隆了人端粒酶RNA组分的基因，命名为hTR（human Telomerase RNA）基因，定位于3号染色体（3q23.3）。hTR基因有约450个碱基的转录本，其中包含5`-CUAACCCUAAC共11个碱基的模板互补序列。这个模板互补序列刚好每次与1.5个（TTAGGG）互补而特异地合成人染色体DNA的端粒（图8-3）。该研究还构建了hTR反义核酸表达质粒，电穿孔法转染HeLa细胞并在HeLa细胞中表达，发现可明显使其端粒长度缩短，抑制HeLa细胞的分裂增殖，从23到26代开始死亡，这一研究为hTR基因作用靶基因的肿瘤治疗开拓了新的途径。5 E6 @" r8 d; M
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图8-3  端粒酶与端粒的延伸
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端粒酶在染色体的3`端结合而发生逆转录，并与端粒TTAGGG聚合，然后端粒酶易位，再次发生逆转录
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三、端粒、端粒酶的功能及其与癌症衰老的关系7 f" B3 S* a* _

  20世纪60年代曾有人认为，不具有编码功能的人染色体的末端DNA的端粒是静止而无变化的。其实端粒的顶端是动态结构，反复地缩短的伸长。20世纪70年代，苏联科学家Olovnikov创造性地将细胞分裂程序的中止与端粒复制问题联系起来。他提出，人体细胞不能改变其DNA复制染色体两端的缩短。这一理论后来被Greider、Harley和Hastie通过研究予研究予以证实：正常人体细胞的端粒都随衰老而缩短，体细胞分裂时都会失去一部分端粒片断。随着年龄的增长，人成纤维细胞分裂的端粒长度呈显著缩短。Leonad和Hayflick等的体外细胞培养研究还表明。不同年龄的个体的体细胞寿命明显不同，其端粒的长度也不同。新生儿的细胞可传代培0-90代，而70岁的老人其体细胞仅能传代培养20-30代。这完全推翻了20世纪60年代的人类体细胞具有无限增殖能力的观点。

  生殖细胞的端粒却例外地不断地被其端粒酶所加长，而得以永久性地分裂增殖。这被解释为生物进化中维持种系生存的需要。爱丁堡医学研究会（MRC）Cooke的实验证明，在种系细甩中端粒被完整地保存下来。因此认为体细胞分完成后，其端粒的长度不再加长而总在缩短，因为此时端粒酶不同志具有活性，体细胞也就丧失了无限增殖的能力。& w) P  ~  l( I: T2 Q9 M

随着细胞不断分裂，端粒的长度越来越短，当达到一个临界长度，细胞染色体即失去稳定性，阻止细胞进一步分裂的信号便发出。细胞将发生凋亡（apoptosis）。端粒的长度决定细甩的寿命，因此可用失去的端粒数来“计数”细胞分裂的次数，端粒被形明地称之为分子钟（molecular clock）或有丝分裂钟（mitotic clock）。

绝大多数恶性肿瘤细胞反常地重新出现端粒酶的活性，发挥其合成端粒的功能，补尝正常的端粒丢失，端粒将不能达到临界长度。如此，这个细胞就不能进入正常的老化和衰亡，从而获得了“永生性”（immortality）。这样，一个恶性增殖的肿瘤细胞克隆便宜告形成。( Y8 Y8 N6 b! A6 k/ R) R$ s
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  对端粒在癌症中所扮演角色的进一步研究认为，或许是细胞增殖失控以后，端粒才被激活。第一个证据是，洛克菲勒大学的Lange和Hastie发现，人肿瘤细胞的端粒比周围正常细胞的端粒要短得多。Hastie检查了结直肠癌细胞的端粒长度，结果显示，在同一病例其端粒长度大部分均短于周围正常黏膜细胞。因此推测，端粒的缩短导致了癌的发生。Greider、Bacchetti和Harley所做的研究解释了这一现象：人为诱使正常细胞产生一种病毒蛋白，这种蛋白可使体细胞对停止分裂的信号无反应。这睦经过处理的细胞在正常细胞进入衰老期后很久，仍然继续增殖，大多数细胞端粒缩短，且测不到端粒酶，最终死亡。但有有数细胞不死，获得永生性。此时端粒虽尺人地短，但是端粒酶却激活。癌变时端粒酶的被激活是“因”还是“果”，尚待进一步研究。
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  绝大多数肿瘤细胞皆有端粒酶的活性。代表性的研究是，Kim利用高度敏感的TRAP-PCR方法，对代表人18种不同组织类型的具有永生性肿胞株的100个标本进行检测，结果显示其中98例呈端粒酶阳性，而22例正常组织标本端粒酶全部阴性；相似地，代表人12种组织学类型的102个肿瘤活检标本，共中90例呈端粒酶阳性，而50例正常体细胞端粒酶全部阴性。这提示不仅端粒酶活性与恶性肿瘤的发生密切相关，而且可能是肿瘤恶性增殖的一个必须因素。
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  需要指出的是，并非所有的正常体细胞绝对没有端粒酶的活性。Counter测出正h常人骨髓及周围血中的白细胞有端粒酶的低水平表达。这一方面提示端粒酶的活性与细胞的高增殖活笥有关，同时也会给针对端粒酶的治疗带来不利影响。1 Q' f8 _- N; _1 [; R7 k7 `+ Z# d

四、端粒酶结构蛋白质及端粒结合蛋白质( r+ L& O  u' m0 A

  最近，关于端粒结合蛋白质及端粒酶结构蛋白质的研究取得了重大进展。在端粒结合蛋白质方面，早在1986年Gottschling等即已鉴定了尖毛虫属（Oxytricha）的相对分子质量为55000和26000的端粒结事蛋白质，该蛋白质特异识识和结合尖毛虫属的大核白质PAP1（repressor activator protein1）是参与端粒长度调节的一个必须因子，一个RAP1分子平均与18个端粒DNA序列结全，负反馈调节端粒长度。Cooper等（1977年）用遗传筛选方法鉴定裂殖酵母端粒相关蛋白Tazlp（telomere-associated protein in Schizosac-charomyces pombe）,并发现Tazlp基因与Myb基因有同源性。Vas Steensel和de Lange的研究表明，人端粒重复结合因子hTRF(human telomere repeat-binding factor)与双链端粒DNA结合，参与调节端粒长度。长期的hTRF1表达导致端粒酶阳性的肿瘤细胞株HT1080的端粒渐进性缩短。相反，hTRF1功能区的诱导突变导致端粒的加长。因此，hTRF1是端粒加长的抑制因子，亦起负反馈调节作用。虽然Tazp、Raplp和hTRF1的结构均不相同，但都具有与Myb相似的DNA结合功能域（DNA binding-domain）。

  在克隆鉴定了酵母等的端粒酶蛋白质部分的催化亚基的编码基因后，人端粒酶蛋白质部分的催化亚基编码基因也已经被克隆鉴定，命名为hTERT(human Telomerase Reverse Transcriptase)基因。该基因含有一个端粒酶特异基序（telomerase-specific motif）,翻译48个氨基酸的蛋白质序列。hTR和hTERT基因的对照表达研究显示，hTR基因可在增殖力强制胎儿细胞---非永生化的（mortal）细胞中表达，而hTERT基因仅在肿瘤细胞---永生化的（immortal）细胞中表达。因此，hTERT基因更显示出肿瘤特异的诊断和治疗潜在应用价值。

  最近，美国麻省Whitehead生物医学研究所Hahn和Weinberg等（1999年）把端粒酶催化亚单位hTERT及活化的ras癌基因和SV40大T抗原基因引入人上皮细胞株（胚肾细胞HEK）或人成纤维细胞（BJ），成功地在体外使这两类正常的人细胞直接呈致瘤性转变。说明了hTERT通过端粒酶活性维持端粒的长度，联合大T抗原对P53及Rb的灭活和ras基因的转化作用，可以使细胞转化成肿瘤细胞。他们还报道，把经过基因工程改造的突变型hTERT注入肠癌、卵巢遂停止生长。该项研究证实了抑制端粒酶的活性能抑制癌细胞的增殖能力，故hTERT可作为抗肿瘤治疗的一种重要的新靶子的价值。

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