DNA甲基化

susanliuxue

一、亚硫酸氢钠修饰过程中可能出现的问题及应对措施
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亚硫酸氢钠修饰DNA的目的是将DNA序列中未甲基化的胞嘧啶完全转化为尿嘧啶，而甲基化的5一甲基胞嘧啶保持不变。影响此过程的主要因素有修饰试剂的浓度、反应温度、反应环境的pH值及反应时间。其中任何一个环节出现问题都将导致MSP扩增失败，体会如下：
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( Y; E5 f  w) K) r+ I. X(1)亚硫酸氢钠的浓度最好控制在3．0～3．9 mol/L为好，其pH值必须用NaOH精确调整至5．0；4 _  @/ h, n9 o
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(2)修饰时间应掌握在10～16 h，修饰时间过长会导致甲基化胞嘧啶也会转化成尿嘧啶且DNA模板破坏加剧，而时间过短会导致修饰不彻底；
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. E8 @& q+ `# K8 l6 k8 P# A(3)反应温度应控制在50～55℃(若用国产恒温水浴箱建议温度设定在53℃为好)；' g" _& t2 j+ g+ y

1 x, t: B8 N0 k' z(4)DNA模板量应控制在<2ug为宜。5 C$ V9 [$ e) b* F7 D

# j$ J, n% S7 E; {1 s! I只要遵循以上几点基本上能保证99％ 未甲基化的胞嘧啶转化尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。但是，此修饰过程中模板DNA有约96％已经降解 。当DNA样品较少时(如石蜡包埋组织、血清DNA)，在纯化回收时可加人适量鲑鱼精DNA或糖原(约1 g)作为载体，有利于DNA沉淀(加入载体后轻轻晃动Ependof管可见絮状DNA富集现象) 。