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作者：高立艳 徐开林 潘秀英作者单位：徐州医学院护理学系，江苏 徐州 221002
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. t$ \( N9 G( g- V 【摘要】 目的 观察粒细胞集落刺激因子（G-CSF）和粒-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）单独、同时或序贯联合应用动员小鼠外周造血干细胞时，外周血T细胞亚群的变化。方法 72只BALB/c小鼠随机分成A、B、C、D、E、对照组6组，皮下注射：A组，重组人（rh）G-CSF 400 μg·kg-1·d-1；B组，rhGM-CSF 400 μg·kg-1·d-1；C组，rhG-CSF 200 μg·kg-1·d-1 rhGM-CSF 200 μg·kg-1·d-1；D组，rhGM-CSF 400 μg·kg-1·d-1（前3天）＋rhG-CSF 400 μg·kg-1·d-1（后2天）；E组，rhG-CSF 400 μg·kg-1·d-1（前3天）＋rhGM-CSF 400 μg·kg-1·d-1（后2天）；对照组，生理盐水0.2 ml，连续注射5天。动态观察外周血白细胞计数，同时通过流式细胞仪测定外周血T细胞亚群的变化。 结果 rhG-CSF与rhGM-CSF联合方案动员外周血白细胞计数较高；动员后各实验组CD 3细胞、CD 3CD 8细胞、CD 3CD-4CD-8细胞增加，CD 3CD 4/ CD 3CD 8比值下降，GM-CSF明显提高了CD 3CD-4CD-8细胞比例。结论 G-CSF和GM-CSF动员小鼠外周血造血干／祖细胞过程中对T淋巴细胞亚群的数量和比例有一定的影响，其可能有免疫调节作用。 & [. @" e$ q6 b, o9 O& \6 g5 d
【关键词】外周血干细胞 动员 粒细胞集落刺激因子 粒-巨噬细胞集落刺激因子 T淋巴细胞亚群
9 K& |/ \: f1 y8 N4 u& D1 J! x, c$ s* j Changes of T cell subsets in the peripheral blood of mice after mobilization of2 e8 E! @/ l# O7 d& ]8 l
- F( h& X6 o9 Z& I1 P1 }: V8 Ohematopoietic stem cells by G-CSF and GM-CSF
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: q+ L" U g y/ A$ c- MGAO Li-yan1, XU Kai-lin2, PAN Xiu-ying2! |7 V' y) f# H* S U
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（1. School of Nursing, Xuzhou Medical College, Xuzhou, Jiangsu 221002, China;
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2. Department of Hematology, Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College）% W4 }3 C" r+ W6 _5 R" _( S( [
. P3 @6 g' c2 s! T9 {, aAbstract： ObjectiveTo observe the changes of T cell subsets in the peripheral blood of mice after the mobilization of hematopoietic stem cells with granulocyte colony stimulating factor （G-CSF） and granulocyte-macrophage colony stimulating factors （GM-CSF） given alone, concurrently, or in sequential combination. Methods72 BALB/c mice were divided into 6 groups （n=12 each）: groups A, B, C, D, E, and the control group to proceed with the following regimens for mobilization respectively: group A. rhG-CSF 400 μg·kg-1·d-1 alone; B. rhGM-CSF 400 μg·kg-1·d-1 alone; C. concurrent combination of rhG-CSF 200 μg·kg-1·d-1 and rhGM-CSF 200 μg·kg-1·d-1; D. sequential combination of rhGM-CSF 400 μg·kg-1·d-1 for 3 days followed by rhG-CSF 400 μg·kg-1·d-1 for 2 days; E. sequential combination of rhG-CSF 400 μg·kg-1·d-1 for 3 days followed by rhGM-CSF 400 μg·kg-1·d-1 for 2 days; and control group. subcutaneous saline 0.2 ml for 5 successive days. The white blood cells （WBC） were counted under microscope; the percentile changes of T cell subsetswere assayed by flow cytometry at serial time points. ResultsThe yields of WBC were significantly higher after the combined use of G-CSF and GM-CSF for mobilization than those after the use of rhG-CSF or rhGM-CSF alone. Compared with that in the control group, the percentages of CD 3,CD 3CD 8 and CD 3CD-4CD-8T cells were all increased, and the ratio of CD 3CD 4/CD 3CD 8 was reduced in the experiment groups. The use of GM-CSF caused marked increase in the proportion of CD 3CD-4CD-8. ConclusionIn the process of mobilization of hematopoietic stem cells, G-CSF and GM-CSF will alter the number and the proportion of T cell subsets, possibly through an immunoregulatory function.. c' e. T2 o# d7 Q, [
7 n$ b3 R% g0 `! C! B; rKey words: mobilization; granulocyte colony stimulating factor; granulocyte-macrophage colony stimulating factor;T lymphocyte subsets
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近年来外周血干细胞移植（PBSCT）技术正越来越多地应用于恶性肿瘤尤其是恶性血液病的治疗。与异基因骨髓移植（allo-BMT）相比，异基因外周血干细胞移植（allo- PBSCT）后造血重建和免疫重建速度均较快，虽然allo-PBSCT输注的移植物中淋巴细胞数量显著高于allo-BMT，但急性移植物抗宿主病（aGVHD）的发病率并没有明显增加，而移植物抗肿瘤（GVT）效应则有所增强，无病生存率提高［1~3］。目前，allo-PBSCT多采用粒细胞集落刺激因子（G-CSF）和粒-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）的动员方案，因此人们除了重视G-CSF和GM-CSF的动员效应以外，也日益重视其在干细胞动员过程中对免疫细胞的作用。我们在比较G-CSF和GM-CSF单独、联合应用动员小鼠外周血造血干细胞效果的同时，对T淋巴细胞亚群的变化进行了初步研究，现报道如下。
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1材料和方法$ Y. E0 z4 M; y9 p
% x3 ?1 D9 a4 b h& C, z$ P0 l1.1实验动物BALB/c小鼠72只，雌雄各半，体重18～22 g，为清洁级近交系小鼠，鼠龄10～14周，购自徐州医学院实验动物中心，按清洁级标准饲养。* \. Y0 g9 z% T. \, {
1 D c9 G3 q% L- ^1 k/ G A1.2主要药品试剂和仪器重组人（rh）G-CSF购自杭州九源基因工程有限公司；rhGM-CSF购自厦门特宝生物工程有限公司；CD45-PC5、CD34-PE、CD38-FITC单抗购自BD公司；培养基IMDM购自Hyclone公司；流式细胞仪（BECTONDICKINGON公司）；CO2培养箱（FORMA公司）。/ S+ _" f8 U0 b5 A; O) y8 a
4 T! O- O+ V: L: s& H$ u1.3分组与给药方法BALB/c小鼠72只，随机分成6组，每组12只。A组： rhG-CSF 400 μg·kg-1·d-1；B组：rhGM-CSF 400 μg·kg-1·d-1；C组：rhG-CSF 200 μg·kg-1·d-1 rhGM-CSF 200 μg·kg-1·d-1，A、B、C各组连续皮下注射5天。D组： 前3天皮下注射rhGM-CSF 400 μg·kg-1·d-1，后2天皮下注射rhG-CSF 400 μg·kg-1·d-1；E组： 前3天皮下注射rhG-CSF 400 μg·kg-1·d-1，后2天皮下注射rhGM-CSF 400 μg·kg-1·d-1；对照组：连续5天皮下注射生理盐水0.2 ml。
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6 e6 I: a2 {, B9 J1.4检测指标2 y( y# G. t# w! }
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1.4.1外周血白细胞计数分别于0~6天连续取小鼠尾静脉血5 μl，加入预先配置的3%的稀盐酸中，混匀后，利用细胞计数板在显微镜下进行白细胞计数。
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3 n6 [! @/ Z! i+ K8 K6 S( v1.4.2外周血T淋巴细胞亚群检测3~6天取小鼠尾静脉血50 μl，加入CD4-Cy单抗5 μl，CD8-PE单抗5 μl，CD3-FITC单抗5 μl混匀，室温下避光20 min进行单抗标记，加入2 ml溶血素后避光8 min，PBS洗涤2次，1000 r/min离心2 min，即上机测定。用流式细胞仪（FCM）检测CD 3细胞、CD 3CD 4细胞、CD 3CD 8细胞、CD 3CD-4CD-8细胞、CD 3CD 4细胞和CD 3CD 8细胞比例。4 d+ ]' t+ `% Z$ D$ |% k8 o6 g
2 v5 S6 E- M) R1.5统计学处理所有数据应用SPSS 11.0软件进行数据处理，采用方差分析和t检验。
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2结果
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2.1动员前后小鼠外周血白细胞的变化除对照组外，各实验组在注射后24 h白细胞升高幅度最大，随用药时间延长白细胞数进一步升高，各组均在第5天达高峰，明显高于对照组和用药前（P﹤0.01）。第5天达高峰时，A、C、D、E各组白细胞数均显著高于B组（P﹤0.01），而 A、C、D、E各组间相比较无显著性差异（P﹥0.05），动员剂停用后24 h各实验组白细胞数均开始下降。提示单用G-CSF或G-CSF与GM-CSF联合的动员方案较单用GM-CSF组白细胞升高更明显（表1）。表1不同动员方案各时间点外周血白细胞计数; [6 m' H; t+ j! U+ f8 N$ A
4 h3 `. j1 |6 E8 y: b8 ?5 }% e. f. q2.2动员前后外周血T细胞亚群变化动员第5天，白细胞升高达高峰时，各实验组外周血CD 3细胞比例均显著高于对照组（P﹤0.001），各实验组间对比CD 3细胞比例无显著性差异（P﹥0.05）。CD 3CD 4细胞、CD 3CD 4CD 8细胞比例，各实验组与对照组相比无明显差异（P﹥0.05）。外周血CD 3CD 8细胞比例，各实验组明显高于对照组（P﹤0.05），各实验组间比较CD 3CD 8细胞比例无显著性差异（P﹥0.05）。动员高峰期各实验组CD 3CD 4/ CD 3CD 8比值较对照组（P﹤0.05）降低，各实验组间无显著性差异（P﹥0.05）。A、B、C、D、E各实验组CD 3CD-4CD-8细胞比例在动员高峰期明显高于对照组（P﹤0.001），CD 3CD-4CD-8细胞增高顺序依次为实验B组﹥D组﹥C组﹥E组﹥A组。提示：动员后CD3 细胞、CD3 CD8 细胞增加，CD4 / CD8 比值下降，各实验组间无显著差异。CD 3CD-4CD-8细胞比例增高以单用GM-CSF组最高，单用G-CSF组最低（表2）。表2不同动员方案各时间点外周血T细胞亚群变化
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4 B. B' n) ^% a8 r- S3讨论
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5 `$ b* ^! A" E2 K4 @* M, F9 zT淋巴细胞亚群在移植免疫中发挥着重要作用，异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）后的aGVHD及自体造血干细胞移植后免疫功能的恢复均与其密切相关。已有研究发现经G-CSF和GM-CSF动员PBSC的过程中T细胞亚群的比例、数量产生了相应的变化，如Th0向Th2、Tc2细胞分化，而Th2、Tc2亚群比例增高，Th1、Tc1亚群降低，从而导致allo-PBSCT后GVT作用增强，aGVHD发生率及严重程度并未增多，而慢性GVHD的发生有增高趋势［1~5］。我们的实验结果显示在G-CSF和GM-CSF动员PBSC的过程中，随着白细胞计数的增高，不同的动员方案对T淋巴细胞亚群产生了不同影响。, H9 S t$ P0 t( c" R# Z+ F
. s! u3 C+ B1 P& p9 S# x3 }
在稳定的生理状态下，存在于骨髓中的免疫细胞为较不成熟的免疫细胞，而外周血中存在的是成熟的、经过胸腺选择的并具有各种功能的效应细胞。研究发现，G-CSF动员后引起T细胞黏附分子L-选择素的表达降低，从而阻碍了T淋巴细胞穿越血管内皮细胞进入淋巴组织或其他血管周围组织，这样T细胞在血管循环池中发生积蓄而使得外周血T细胞数量在动员后大量升高［6-7］。大量动物实验发现，G-CSF动员能够极化T细胞所分泌的细胞因子，使T淋巴细胞亚群发生变化，IL-4、IL-6、IL-10等Ⅱ类细胞因子分泌增加，而促发GVHD发生的IL-2、TNF-α、IFN-γ等Ⅰ类细胞因子分泌减少，aGVHD的发生率和严重程度降低［4-5,8］。本实验结果表明，细胞因子在动员小鼠PBSC的同时，改变了小鼠外周血T淋巴细胞的数量及比例，各实验组CD 3细胞、CD 3CD 8细胞比例明显高于对照组，CD 3CD 4/ CD 3CD 8比值低于对照组，初步提示免疫应答的负调节占优势，具体的免疫调节机制需进一步分析CD 3CD 4、CD 3CD 8细胞分别向Th1、Th2、Tc1、Tc2分化的能力。; c F0 k! `% m
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在T淋巴细胞的分化过程中，最先出现的是CD 3CD-4CD-8细胞，在经过胸腺的过程中进行阳性选择及阴性选择后，细胞表达CD 3CD 4CD 8，当此种细胞经过胸腺髓质的过程中，CD 3CD 4CD 8细胞进一步分化为CD 3CD 4细胞和CD 3CD 8细胞，进入外周血循环并执行其生理功能。研究结果显示，在G-CSF/GM-CSF动员小鼠PBSC的同时，CD 3CD-4CD-8细胞在外周血的比例明显增高。CD 3CD-4CD-8细胞为外周血成熟T细胞的前体细胞，动员后明显上升，说明T淋巴细胞与造血干细胞迁移具有较好的一致性。CD 3CD-4CD-8细胞又称为自然抑制细胞，能够抑制混合淋巴细胞反应中的增殖反应并可抑制CD 3CD 4、CD 3CD 8细胞对异体细胞的细胞毒作用，从而降低了allo-PBSCT后aGVHD的发生率［9-10］。亦有研究发现CD 3CD-4CD-8细胞是通过抑制CD 3 CD 8细胞的活化、增殖，并通过Fas-FasL途径破坏已激活的CD 3 CD 8细胞、CD 3CD 4细胞而实现免疫抑制作用［11~13］。因此，细胞因子动员后CD 3CD-4CD-8细胞的过度表达可能有利于抑制aGVHD，对T细胞增殖、分化功能的改变起着协同作用。从不同动员方案CD 3CD-4CD-8细胞数量变化中也说明GM-CSF或GM-CSF与G-CSF联合的方案较单用G-CSF方案有可能降低GVHD发生，促进细胞免疫功能发挥。基于此，目前国内在进行非血缘或半相合allo-HSCT时已将G-CSF/GM-CSF动员后的骨髓＋外周血造血干细胞作为移植物可减轻GVHD的发生而保留GVT效应并取得了较好的移植效果［14］。
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