TBI和环磷酰胺选择性去除同种异基因反应供者淋巴细胞的研究 - 国内文献区干细胞之家



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发表于 2009-3-3 11:38 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

作者：陈宝安，董伟民, 丁家华，孙雪梅，邓晓静, 张琰，毕延智，赵刚, 高冲，孙耘玉，王骏，程坚，Schmitt M2 ，Schmitt A2作者单位：东南大学附属中大医院血液科，南京 210009；1南京市鼓楼医院血液科，南京 210009；2乌尔姆大学医学院内科Ⅲ区，德国 89081 : O# u6 h! w% Y) Z1 [& y3 V
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      【摘要】  　　本研究用全身照射(TBI)和环磷酰胺（CY）选择性去除同种异基因反应的供者淋巴细胞,为预防移植物抗宿主病(GVHD)的发生探索新的手段。以(BALB/c×C57BL/6)F1雌性小鼠（H2d/b）为受鼠，于第0天接受亚致死量的60Coγ射线全身照射，总剂量为4 Gy，第1天接种P388D1白血病细胞，第2天输注由C57BL／6雄性小鼠（H2b）为供鼠提供的MHC不匹配的供者脾淋巴细胞，在造血干细胞移植前诱导移植物抗白血病效应（GVL）。第6天腹腔注射环磷酰胺（CY）200 mg/kg或再次TBI 9 Gy，选择性去除同种异基因反应供者淋巴细胞，第7天输注(BALB/c×C57BL/6)F1雄性小鼠（H2d/b）提供的骨髓造血干细胞。结果显示：以CY和TBI选择性去除同种异基因反应供者淋巴细胞组的小鼠无白血病和GVHD的发生，生存期超过了210天，于移植后第21天出现完全供者嵌合，然后嵌合率下降，第90天表现为混合嵌合体（MC）。对照组的小鼠出现了白血病和GVHD，出血、感染明显，生存期短，为20-36天（P& E+ ^( i. _7 Q/ W. Y+ s
      【关键词】同种异基因造血干细胞移植；同种异基因反应供者淋巴细胞；移植物抗白血病效应；移植物抗宿主病；全身照射；环磷酰胺- }+ E$ H4 U$ X! q2 \; Q
   　　Selective Elimination of Alloreactive Donor Lymphocytes by Using TBI and Cyclophosphamide
, T. F' t5 O" u- M4 a, Z6 O( X
CHEN BaoAn，DONG WeiMin， DING JiaHua，SUN XueMei1，DENG XiaoJing, ZHANG Yan，

BI YanZhi，ZHAO Gang，GAO Chong，SUN YunYu，WANG Jun，CHENG Jian，Schmitt M2，Schmitt A2
/ h$ a4 O& P: B% b
Department of Hematology，Zhongda Hospital of Southeast University，Nanjing 210009，China；1Department of Hematology，Gulou Hospital of Nanjing，Nanjing 210009，China；2ThirdDepartment of Internal Medicine, Medical College, Ulm University, Ulm 89081,Germany& Y" C9 l, r5 S
& I6 z8 h/ t6 Q. o! P- b. b& V0 ^
AbstractThis study was aimed to investigate a new method of avoiding graftvshost disease (GVHD)through selective elimination of alloreactive donor lymphocytes by using total body irradiation (TBI) and cyclophosphamide (Cy). Female (BALB/cC57BL/6)F1 mice (H2d/b) as recipients received 60Co γray sublethal TBIof 4 Gy on day 0 followed by being inoculated with P388D1 leukemia cell line on day 1,injection of allogeneic splenocytes fromC57BL／6 male mice（H2b） was carried out for induction of graftvsleukemia (GVL) effect prior to stem cell transplantation (SCT) , intraperitoneally injection of cyclophosphamide (Cy) (200 mg/kg) and TBI (9 Gy) was given on day 6. One day later, treated mice were rescued withbone marrow hematopoietic stem cells from(BALB/cC57BL/6)F1 male mice（H2d/b）. The results showed that recipients had no occurrence of leukemia and GVHD throughselective elimination of alloreactive donor lymphocytes by Cy and TBI, survived more than 210 days，the completedonor chimerism occured on day 21 after transplantation. The ratio of chimerism descended subsequently, but still displayed mixedchimerism at 90 days. Control mice died ofGVHD, leukemia or other deathrelatedtransplantation within 20 to 36 days（P
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Key wordsallogeneichematopoietic stem cell transplantation；alloreactive donor lymphocyte；graftversusleukemia；graftversushost disease; total body irradiation; cyclophosphamide! q" f; ^' I/ V! @& w1 n

J Exp Hematol 2007; 15(2):332-336
- c. I. ~% D' N
异基因外周血造血干细胞移植(alloHSCT)是治疗恶性血液病和某些实体瘤的重要手段，移植物抗宿主病(GVHD)是异基因外周血造血干细胞移植主要的并发症和死亡原因。目前预防GVHD的措施主要是在移植前后应用细胞毒药物和免疫抑制剂，虽可明显降低GVHD的发生，但也减弱了移植物抗白血病效应（GVL）或移植物抗肿瘤效应（GVT），从而导致白血病或肿瘤的复发。本研究探讨造血干细胞移植前诱导移植物抗白血病效应。我们在造血干细胞移植前输注不相匹配的供者淋巴细胞,然后再用全身照射（TBI）和环磷酰胺（CY）选择性地去除同种异基因反应的供者淋巴细胞来预防移植物抗宿主病的发生。5 q% {, O/ ?+ j5 r

白血病细胞株8 U6 u1 ^' Q+ `
% z% A' N# g4 Q9 }' A
小鼠急性淋巴细胞白血病细胞系Ｐ388Ｄ1(Ｐ388)购自中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库，然后将其置于RPMI1640(Gibco公司产品)培养液(含15%小牛血清,碳酸氢钠1-2 ｇ/Ｌ,ＨＥＰＥＳ 2.38 ｇ/Ｌ,Ｇｌｕ 300 ｍｇ/Ｌ,青霉素、链霉素各200 Ｕ/Ｌ)进行传代培养,每3-4天传代1次。培养条件:5% ＣＯ2、饱和湿度、37℃。

动物
) e/ F) M& l# _# T
受鼠为清洁级(BALB/cC57BL/6)F1雌性小鼠（H2d/b），10-12周龄，体重19.5±1.5 g；供鼠为清洁级雄性C57BL/6小鼠(H2b,B6)和(BALB/cC57BL/6)F1雄性小鼠（H2d/b），由扬州大学畜牧兽医学院提供，均饲养于东南大学医学院SPF级动物房内，饲料及垫料均经辐照消毒，饮用高压消毒无菌水。

试剂及器材1 T0 r, L6 S# b6 o: K

环磷酰胺（CY，200毫克/支）为上海华联制药有限公司产品，TRIzoL RNA抽提试剂盒为Invitrogen公司产品，60Co放疗机（中国核动力研究设计院研制的GWGT80型60Co远距离治疗机），由南京市第二人民医院提供帮助。
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移植细胞的准备
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C57BL／6雄性（H2b）供鼠,颈椎脱位法处死, 75 %的乙醇中浸泡5分钟,无菌条件下取出脾脏,置于200 目金属过滤网上,用研磨棒轻轻按压,用RPMI 1640 培养液冲洗,细胞悬液洗涤3 次,计数,调整浓度为5107/ml 。(BALB/cC57BL/6)F1雄性供鼠（H2d/b）同样在无菌条件下剥离股骨及胫骨,剪去两端,用RPMI1640 培养液冲出骨髓,制成细胞悬液,洗涤3 次,计数,调整细胞浓度为1108/ml；

白血病细胞接种、脾淋巴细胞输注和骨髓移植
: T% ~3 M" o1 \, F6 m
(BALB/cC57BL/6)F1雌性受鼠（H2d/b）,移植前5 天开始饮用含红霉素250 mg/L 、庆大霉素320mg/L 的冷却开水。第0 天置于清洁级包装的塑料盒内接受60Coγ射线4.0 Gy全身照射，照射距离80 cm , 照射时均为立式体位,剂量率500 cGy/min。第1天接种P388D1白血病细胞株0.5 ml,含细胞数0.5107,第2天输注由C57BL／6雄性小鼠（H2b）为供鼠提供的MHC不相匹配的供者脾淋巴细胞0.3 ml，细胞数1.5107,第6天腹腔注射环磷酰胺（CY）200 mg/kg或再次TBI 9 Gy，照射方法同前,第7天输注由(BALB/cC57BL/6)F1雄性小鼠（H2d/b）提供的骨髓细胞0.3 ml,含细胞数3107。1 [" s9 X4 w. y
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实验分组# W8 }# a) a( y/ Q

将(BALB/cC57BL/6)F1雌性受鼠（H2d/b）随机分为6组。A组：TBI＋输注白血病细胞株P388D1（n=8）；B 组：TBI＋输注白血病细胞株P388D1＋脾淋巴细胞输注（n=8）；C组：TBI＋输注白血病细胞株P388D1＋脾淋巴细胞输注＋TBI（n=8）；D组：TBI＋输注白血病细胞株P388D1＋脾淋巴细胞输注＋ＣＹ（n=8）；E组：TBI＋输注白血病细胞株P388D1＋脾淋巴细胞输注＋TBI＋骨髓细胞输注（n=8）；F组：TBI＋输注白血病细胞株P388D1＋脾淋巴细胞输注＋CY＋骨髓细胞输注（n=8）。& A( C: P6 n5 V5 }% x5 j

主要的观察项目8 b: r3 x7 |- a% i% {, f0 R6 g0 `
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一般状况移植后每日观察受鼠体形、体位、毛发、进食及精神情况,有无弓背、翘毛、腹泻等表现,定期称量体重,记录每只小鼠的存活时间并计算存活率，存活时间超过60天者为长期存活。

外周血白细胞计数及形态学检查取尾血,白细胞稀释液稀释,常规计数白细胞,镜下观察白细胞形态并分类。
* v, u: [- @. z
病理学检查解剖死亡受鼠,大体观察脏器的形态，然后取肝、脾、肺、小肠和足底皮肤等组织标本，用10 %的甲醛固定,常规包埋、切片、HE 染色后镜下观察形态变化，判断白血病和GVHD情况。' b- N8 e+ @2 E, H: p

异基因嵌合体用RTPCR测定，于移植后第21、60、90天分别经内眦静脉取各组小鼠外周血250 μl，EDTA抗凝后，Ficoll分离淋巴细胞后再提取RNA，然后经逆转录成cDNA。再行PCR扩增： SRY基因引物用DNAStar软件设计，由上海生工生物工程公司合成，上游引物序列为5′ATTTATGGT GTGGTCCCGTGGTGA3′，下游引物序列为5′ATG TGATGGCATGTGGGTTCCTGT3′，扩增产物为305 bp；以GAPDH为内参照，上游序列为5＇GGTGTG AACGGATTTGGCCGTATT3＇，下游序列为5＇GAG CCCTTCCACAATGCCAAAGTT3＇，扩增产物为504 bp。PCR反应体系：10PCR缓冲液5 μl，25 mmol/L MgCl25 μl，dNTPs 1 μl，25 μmol／L上游及下游引物各0.5 μl，DNA模板2 μl，TaqDNA聚合酶0.5 U（大连宝生物公司提供），用灭菌双蒸水补足至50 μl。扩增条件：94℃预变性2分钟，94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸1分钟，循环35次，72℃再延伸7分钟。扩增产物在含0.5 mmol／L溴化乙锭的1％琼脂糖凝胶中以4-5 V/cm电压降电泳30-45分钟，于Image Master VDS凝胶扫描仪上成像。用Totallab V2.01凝胶图像分析软件进行定量分析。: k. ]( h$ a$ |  ~% n8 W0 s
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死亡原因判别标准# L3 }4 Z0 G9 _- d! T
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白血病死亡接种白血病细胞后肝脾明显肿大、腹水、外周血白细胞升高,涂片见大量细胞,病理学见肝、脾、肺等组织中大量P388D1细胞浸润。

GVHD在移植后2 周左右出现弓背、翘毛、腹泻、体重减轻、精神萎靡等表现,参照文献［1］判别有无GVHD 病理学改变。

出血、感染死亡在本实验中除白血病死亡及GVHD死亡外,在移植前后出现的造血抑制所致感染、出血等原因引起的死亡。

统计学处理

采用SPSS 11.O专业软件进行分析，数据以±SD表示，进行方差分析、t检验。3 X3 f" L2 y% ?

结果
8 ]* S/ `$ p# Z& `4 T' N3 s8 c
生存时间
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各组生存时间见附表。由附表可见，C组与D组和E组与F组生存时间，经统计学处理差异无显著性(P>0. 05) ； E组和F组与其他组比较，生存时间经统计学处理有显著性差异（P 均
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体重变化情况8 c- c3 G8 u1 _
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A组：出现腹水，体重增加，很快死亡。B组：在脾淋巴细胞输注后1周左右体重开始减轻，直至死亡。C组和D组：在大剂量TBI和CY后3-5天左右体重开始减轻，直至死亡。E组和F组：在用同基因骨髓解救后2-3周体重减轻，至第6周开始体重稳步增加，生存期超过210天。

GVHD的发生$ u& p* r4 g! L4 P1 J/ e% l* ]
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B组的小鼠均出现不同程度的弓背体位、翘毛、体重下降、消瘦、精神萎靡、腹泻等表现，死于严重的GVHD。取肝脾行病理检查，结果符合GVHD表现。肝脏：肝细胞空泡样变，汇管区内有大量淋巴细胞浸润，可见灶状出血。脾脏：体积萎缩，巢状结构破坏，可见大量散在浸润的淋巴细胞、出血坏死灶及含铁血黄素的沉积；C组和D组生存时间短，无GVHD的发生。E组和F组小鼠目前仍存活，无GVHD的发生，生存时间超过230天。: p6 K! S! ^6 E! |
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移植相关并发症和相关死亡& H3 i+ I( w. R1 v0 |( t# N

A 组小鼠100 %在8天死于白血病，B组小鼠均在4周内死于严重的GVHD，C组和D组在3周内死于造血抑制所致的感染、出血，而E 组及F组均无移植相关并发症引起的死亡。
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外周血白细胞计数及形态观察& H; k1 Y" D, r* h
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正常(BALB/cC57BL/6)F1雌性受鼠（H2d/b）WBC 为(9.25±1.75) 109/L ,接种白血病细胞后发生白血病，WBC 高峰值达(156.6±32.35) 109/L,涂片有大量P388D1细胞。A组小鼠在接种P388D1白血病细胞株后均于5-9天发病并很快死亡，其余组无白血病发病死亡。

嵌合状态' y: y$ q3 o+ U, i& G" N
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E组和F组小鼠分别于移植后21天、60天、90天取外周血行RTPCR检查嵌合率。结果表明，E组小鼠在21天、60天、90天的嵌合率分别为98.5％、75％、60%左右；F组小鼠在21天、60天、90天的嵌合率分别为98％、73％、55%左右（附图）。E组和F组的小鼠在21天是为完全异基因嵌合,但随移植后时间的推移异基因嵌合比例逐渐下降，在90天仍保持混合嵌合状态。9 q, @& K) W: [: m
9 q9 ?# s8 w$ O
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讨论
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同种异基因反应性T细胞对外来异己的主要组织相容性复合体（ＭＨＣ）分子和结合肽产生直接的免疫应答，是ＧＶＨＤ和同种异基因移植物排斥的原因。同种异基因反应性T细胞介导了移植后的GVL或GVT效应［2］。直接的同种异基因反应性是自身ＭＨＣ限制性T细胞交叉反应识别的结果，并且逃脱了胸腺阳性选择的限制［3］。我们的实验研究表明，有意使用不相匹配的供者淋巴细胞诱导了恰当的、快速的移植前GVL（pGVL）效应，紧接着用大剂量CY或TBI在GVHD的早期阶段选择性地去除了同种异基因发应的淋巴细胞，从而预防了GVHD的发生。当前防治GVHD的方法主要是应用霉酚酸酯（MMF）、环孢霉素A（CsA）、甲氨蝶呤（MTX）、环磷酰胺（CY）和皮质醇激素等，然而GVHD仍然是成功进行异基因造血干细胞移植的主要障碍。从上个世纪80年代开始，在恶性血液病和某些转移性实体瘤中已经观察到了GVHD与GVL（或GVT）效应呈正相关，同样在一些非恶性血液病中也观察到了有益的抗宿主效应［4,5］。

Gendelman等［6］报道了移植前选择性地去除同种异基因反应供者淋巴细胞可以减轻GVHD和促进T细胞的免疫功能重建。我们的实验研究的主要目的是最大化GVL效应，同时通过去除对于ＣＹ和TBI敏感的供者淋巴细胞的同种异基因反应性，阻断T细胞的同种异体活性、增殖性和一系列的炎症因子的产生，防止了GVHD的发生。虽然一些通过靶向杀死供者T细胞和阻断炎性细胞因子来预防和治疗早期GVHD的方法目前仍处于临床前和临床试验阶段，但是对于pGVL效应的应用研究却尚未起步。我们的研究是基于pGVL效应可以被用来去除对放化疗耐药的白血病细胞的假设，特别是在微小残留病变阶段（MRD）。在临床上，可以通过使用单倍相合的异基因T细胞或NK细胞增强供者淋巴细胞的同种异基因反应潜能，从而获得快速有效的GVL效应。Nagler等［7］已经证明了清髓性放化疗耐药的白血病细胞能在5天之内被单倍相合性的异基因淋巴细胞清除。Solomon等［8］在老年患者的非清髓移植治疗中通过抗CD25免疫毒素体外选择性去除同种异基因反应供者淋巴细胞有效降低了GVHD的发生的严重程度，提高了存活率。Yung等［9］的最近的研究显示，在DLI后的2周用CTX（200 mg/kg）可以去除同种异基因反应性供者淋巴细胞来预防GVHD的发生。
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应用异体移植物细胞清除白血病细胞和应用同种异基因反应淋巴细胞清除某些实体瘤细胞的方法都已经得到了证明［10］。由于快速增殖的T细胞对CY和TBI敏感，而且CY和TBI在细胞分裂间期能够阻断淋巴细胞的分裂和影响复制的、非复制的淋巴细胞，所以应用CY和TBI作为GVHD的防治手段，即在用完大剂量的CY和清髓性的TBI后，可再用同基因的造血干细胞来拯救是可行的。在我们的实验研究中发现，用CY和TBI选择性地去除异基因反应供者淋巴细胞组的小鼠无白血病和GVHD的发生，生存期超过了210天，于移植后第21天出现完全供者嵌合(CDC)，然后嵌合率有下降，第90天时表现为混合嵌合体（MC）。而对照组的小鼠出现了明显的GVHD、白血病或其他的移植相关死亡，生存期短20-36天。大体而言，在临床上，同种异基因的骨髓细胞在完全匹配的受者身上做拯救治疗时是更有效的，由供者淋巴细胞（T、NK）诱导的GVL效应能够预期出现。而在不相匹配的造血干细胞移植中只有强制性去除T细胞或使用阳性选择的CD34＋细胞或AC133＋细胞时才能避免GVHD的发生。在我们的实验研究中，选用同基因的而不是同种异基因的造血干细胞来做拯救性治疗是因为想评估由GVHD的接种物诱导的pGVL效应，同时也避免了同种异基因造血干细胞自身拯救过程中诱导的GVL和GVHD的发生。
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在诱导pGVL效应前用亚致死性TBI（4Gy）的原因有三：第一，去除受者的淋巴细胞，为供者淋巴细胞提供适当的骨髓空间，产生更为有效的GVL效应，而TBI是创造骨髓空间最为有效的方法之一；第二，去除公认的受者起源的veto淋巴细胞，下调供者起源的同种异基因反应细胞的功能；第三，移植前的免疫抑制能导致供者GVL效应细胞较好的植入，产生期望的GVL效应，随后通过去除同种异基因反应的供者淋巴细胞来预防GVHD发生［11］。# z+ J/ U: f: A+ Y: @2 n8 F
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