急！原代培养，细胞消化打散后碎片太多！

beidouhan

我们一般用的是10ml的吸管，力度要控制好，枪别打那么大劲，有规律的上下前后吹几下就可以了，一般都很好消化的

tangxiao

楼主，你好，我现在做的胶质瘤细胞原代培养，做过多次；0.25%trypsin，10min，吹散后基本都是脆片，看不到细胞，费解？! `) n- s/ h; Z9 N( `
愿意进一步交流：qq351748271

mumudan

楼主，你们取原代SVZ区域的时候是在解剖镜下如何获取的，可不可以交流下？我也在做成体神经干，对于取材和消化这两块也在摸索中！

SVZ

1.碘伏消毒头部----酒精脱碘-----PBS清洗----棉球棉擦干
. p' g. A: f3 n. @/ g2.剪开头皮,暴露出颅骨。从双耳后剪开头皮暴露头盖骨侧面，剪开两边头盖骨（打开头盖骨上部，避免损伤   脑组织）。用镊子掀开头盖骨。用弯镊在脑底部滑动以切断连接脑底部的脊髓、血管和颅神经。取出大脑，置冰PBS中。
8 `1 C* U( F: x, z- d4 m# l6 m3.洗除血迹，放入另一管冰PBS中。& O8 Z" I( z" L) [
4.在超净台下，培养皿中倒入预冷的D-Hanks液。9 s) w/ v( P$ v
5.将大脑取入冰D-Hanks液中，在显微镜下，用精细眼科镊去除脑膜和微血管。+ j5 N6 [! A; U: V) G3 X' P4 L
6.将大脑约1／2处横断，保留前脑(近嗅球端)，沿中线分为两半。将半脑外侧面朝下，用一只镊子固定，另一只镊子去除剩余的海马、SVZ内侧壁，见SVZ外侧壁呈月牙型，上下侧与白质相连，界限清晰。手术刀分离之，去除四周的白质纤维。! V7 E% }  y3 F6 @. h2 [  E
7.分离两侧SVZ将取出的SVZ置于培养皿（冰浴）中。

SVZ

取SVZ，我摸索过三种方法，以上是一种，还可以，另外两种：
# q+ h0 y7 k+ W  {1。以上的方法，除剩余的海马、SVZ内侧壁，见SVZ外侧壁呈月牙型，上下侧与白质相连，界限清晰。用精细的手术剪，直接沿着SVZ的弧度将SVZ区剪下来，这样取材相对准确，个人认为。
: }4 Q4 Z: J; o5 X2。大脑约1/2处横断，再向前（嗅球端），横切下约2mm厚的脑片，很清晰的可以看到SVZ，去除SVZ内侧壁，再用手术刀在显微镜下切下SVZ的内侧壁，并去除白纸纤维。+ ^1 F# P' J5 A* C8 O. g4 s
注意，不要垂直切，根据SVZ倾斜的弧度来切，取材更准。这种方法很容易操作，但是只能取到部分SVZ。

SVZ

回复tangxiao ：; G, P  {) [* @. O1 _8 P2 h! u

  l' e. P5 Q! a& [4 ]- k成体干细胞较胎体的难养的多，个人体会。至于细胞碎片，因为我们养的细胞不一样，我不敢妄下定论，以下建议仅供参考：* g0 }1 x; C' s& |8 l
  从你胰酶的用量和消化时间来讲，应该不为过。但也有很多人认为0.25%的浓度过大，10min消化时间长。但是，我有师姐做胎鼠神经元培养，用的就是这个浓度，时间是15min，培养的细胞很漂亮。所以，可能不同细胞消化的敏感性不一样，细胞培养没有金标准，还是要根据自己的情况多摸索一下。也应考虑一下其他因素，比如离心，和吹散的手法？吹打的时候建议用进口的枪头。手法尽量轻柔。
; b8 I6 X  Q4 {) D1 O* s2 n  q/ j祝你早日成功！

sfk06

胰酶的浓度和消化时间不太合适，要摸降低胰酶浓度要摸缩短些消化时间 在试试

junjunxu

脑组织消化后存在很多的杂质是属于正常情况，可以考虑用低速离心或者分离液的办法将杂质去掉；4 Y8 J: U8 S, z
是否分享SVZ取材的方法？

luoye1986

应该是消化过头了，酶液浓度低些，换成0.05%试试

smkx

回复 9# SVZ 8 {- ]$ C) H3 N

! ?4 ?- f  ^5 B$ [6 ~! J  |8 _8 d: k! u3 y9 `1 h+ P
    胎鼠的LGE/MGE组织好像不需要消化。直接吹打即可成为单细胞。可否对比下我们所使用的培养基体系？我的是DMEM/F12, N2  ,2mML-Glu,15mM HEPES, 0.6%  glucose , 1.125%  sodium  bicarbonate , gentamicin (0.05 mg/ml) ,10ng/ml bFGF,20ng/ml EGF.